В настоящее время иммунохимические тест-системы широко используются для измерения концентрации гормонов на высокопроизводительных аналитических платформах. Такие тест-системы, как правило, мало подвержены интерференции. Однако при тестировании образцов некоторых пациентов в тест-системах, использующих взаимодействие стрептавидина и биотина, может возникать эндогенная аналитическая ошибка, связанная с употреблением пациентом биотина или присутствием антистрептавидиновых антител. В этих случаях интерференция может приводить к получению как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов и способствовать имитации определенного гормонального профиля. Есть опасения, что число ошибок такого рода будет расти. В этом обзоре подчеркивается важность тесного взаимодействия между сотрудниками лаборатории и клиницистами с целью сопоставления результатов гормонального исследования с клинической картиной.

Использование иммунохимических тест-систем в клинических лабораториях растет благодаря эффективным технологиям, позволяющим проводить большой объем исследований. Их полная автоматизация обеспечивает множество аналитических преимуществ: высокую чувствительность, точность и быстроту измерений концентрации гормонов в сыворотке, а также многих других аналитов. Несмотря на общую устойчивость к интерференциям, все иммунохимические тест-системы уязвимы в отношении эпизодических эндогенных аналитических ошибок в образцах некоторых пациентов. Более того, неудачная комбинация ложнозаниженных и ложнозавышенных результатов может имитировать патологический гормональный профиль. Это касается двух различных форматов иммунохимических тест-систем, в которых нарушение формирования иммунных комплексов приводит к получению результатов, противоположных истинным, что может стать причиной ошибочных диагнозов гипертиреоза [1—3], интоксикации витамином D [4] или подавления выработки паратиреоидного гормона (ПТГ) [5]. Наше внимание к этой проблеме привлекли некоторые новые протоколы лечения неврологических заболеваний, включающие высокие дозы биотина (300 мг) [1—3, 6]. Существует опасение, что возникающие из-за интерференционного влияния биотина как ложнозавышенные, так и ложнозаниженные результаты могут встречаться все чаще.

Для правильной интерпретации результатов лабораторных исследований и выявления потенциально ошибочных результатов необходимо точное понимание аналитических принципов. Здесь будут рассмотрены задействованные механизмы и случаи ошибочной диагностики, а также стратегии действий для выявления и исключения подобных ошибок.

Технология иммунохимического исследования по типу «сэндвич» используется для измерения концентрации крупных молекул, таких как тиреотропный гормон (ТТГ), гликопротеиновые гормоны гипофиза, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), паратгормон (ПТГ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), инсулин, тиреоглобулин, С-пептид. Этот тип иммунохимических тест-систем также называют «двухсайтовым» из-за двустороннего связывания эпитопов. Например, ТТГ оказывается «зажат», как в сэндвиче, между двумя различными антителами: одно связано с меткой, испускающей сигнал, подлежащий измерению (люминесцентное или флюоресцентное соединение, фермент, изотоп); другое, называемое «иммобилизированным антителом», позволяет закрепить иммунные комплексы на твердой фазе. Чем выше концентрация ТТГ, тем выше концентрация сигнальной метки, связанной с твердой фазой. Таким образом, калибровочная кривая является восходящей, так как концентрация сигнальной метки прямо пропорциональна концентрации ТТГ в образце. Этот формат обеспечивает высокую чувствительность, специфичность и надежность анализа.

Формат «сэндвича» не подходит для небольших молекул, которые слишком малы, чтобы два антитела могли связаться с ними без пространственных затруднений, например все стероиды, Т₃ и Т₄ — общая и свободная фракция, 25-гидроксивитамин D (25 (OH)D). Многие тест-системы для определения антител также разработаны в соответствии с «конкурентным» форматом, такие как антитела к рецептору ТТГ (АТ-рТТГ), антитела к ТПО, антитела к тиреоглобулину. В качестве примера можно взять количественное исследование на кортизол. Образец инкубируют с антителами к кортизолу и трейсером (кортизол, связанный с меткой, испускающей измеримый сигнал: ферментом, флюоресцентным или люминесцентным соединением, изотопом). Кортизол образца и меченый кортизол конкурируют за участки связывания антител. Молекулы кортизола связываются с антителами и захватываются твердой фазой аналогично «сэндвич»-тесту. Но в отличие от «сэндвич»-теста чем выше концентрация кортизола в образце, тем меньше концентрация меченого кортизола, связанного с антителами. В этом случае калибровочная кривая является нисходящей, так как концентрация сигнальной метки, связанной с твердой фазой, обратно пропорциональна концентрации кортизола в образце.

В конце инкубации в обоих форматах теста гормон, связанный с антителами реагента, отделяют от реакционной среды. Затем измеряют сигнал, который испускает метка, связанная с этими иммунными комплексами. Выбор методологии формирования иммунных комплексов разный у каждого производителя реагентов для каждого аналита. Взаимодействие стрептавидина и биотина обеспечивает эффективный и удобный метод формирования комплекса антител реагента (биотинилированное антитело или биотинилированный антиген соединяются со стрептавидином, связанным с твердой фазой). Для каждого исследования строится калибровочная кривая с использованием определенных концентраций аналита. Любые вещества, препятствующие формированию иммунных комплексов, потенциально могут повлиять на результат: например, биотин приводит к ложнозавышенным или заниженным результатам концентрации гормонов в конкурентном (см. рисунок,

В зависимости от дизайна рассматриваемых иммунохимических тест-систем могут встречаться как ложнозавышенные, так и ложнозаниженные результаты у одного и того же пациента, а их комбинация может имитировать патологическое гормональное состояние. Например, можно ожидать повышения концентрации свободного T₃ (Т₃св), свободного T₄ (Т₄св) и (АТ-рТТГ) одновременно с низким уровнем ТТГ. Возможна высокая кортизолемия вкупе со сниженной концентрацией адренокортикотропного гормона (АКТГ) или повышенная концентрации 25 (OH)D, сопровождающаяся сниженным уровнем ПТГ (табл. 1).

Иммунохимические тест-системы, основанные на взаимодействии стрептавидина и биотина, широко используются многими производителями реагентов. Это связано с высокой аффинностью, стабильным взаимодействием двух веществ, а также доступностью различных химических и ферментативных методов биотинилирования без изменения свойств молекулы. Твердая фаза, покрытая стрептавидином, также может эффективно использоваться в различных иммунохимических тест-системах. С другой стороны, за последние годы потребление биотина пациентами значительно выросло, и теперь он не только назначается в качестве лечения, но и продается в интернет-магазинах в виде витаминной добавки [7, 8]. Поэтому необходимо уделять особое внимание терапии биотином.

Биотин — водорастворимый витамин B-комплекса, также называемый витамином B₈ (или B₇) или витамином H. Он является коферментом, ответственным за перенос карбоксильной группы в пяти жизненно важных карбоксилазах; биотин участвует во многих метаболических процессах. По оценкам, рекомендуемая суточная доза у взрослых составляет 30 мкг [9], при этом концентрация в крови достигает 0,12—0,36 нмоль/л [10]. Обычного употребления биотина с пищей недостаточно, чтобы повлиять на иммунохимические тест-системы [11]. Однако пациенты с наследственными метаболическими заболеваниями, такими как пропионовая ацидемия, недостаточность биотинидазы, и пациенты на парентеральном питании получают более высокую суточную дозу биотина перорально в пределах 10—40 мг/сут в зависимости от заболевания [12, 13]. Биотин в дозах, превышающих физиологические, также используют при самолечении, направленном на уменьшение выпадения волос или укрепление волос и ногтей (до 20 мг в день). Биотин иногда входит в состав биодобавок для улучшения состояния волос, ногтей и кожи неназванным и не рассматривается пациентом как лекарство, стоящее упоминания [8]. Совсем недавно очень высокая доза биотина (300 мг/сут) была предложена в некоторых клинических протоколах по лечению рассеянного склероза и демиелинизирующих заболеваний [14].

В табл. 2 представлены

По данным программы внешней оценки качества Probioqual, широко используемой во Франции (результаты за июнь 2016 г.), методы на основе взаимодействия стрептавидина и биотина используются в 500 из 953 иммунохимических тест-систем для измерения ТТГ, в 509 из 810 для оценки Т₄св, в 442 из 709 для Т₃св, в 242 из 513 для ПТГ, в 221 из 535 для 25 (OH)D. Таким образом, эта технология формирования иммунных комплексов используется приблизительно в 50% гормональных иммунохимических исследований.

Кроме того, во многих твердофазных иммуноферментных тестах используются планшеты с микролунками, покрытыми стрептавидином. В этом случае результаты у пациентов, получающих биотин, могут быть ошибочными. Учитывая широкое использование биотинилированных соединений в качестве реагентов в различных биотехнологиях, интерференция с биотином заслуживает более широкой известности среди научно-исследовательских групп, поскольку они не всегда знакомы с лабораторной медициной и могут не знать об этой проблеме.

Сообщалось о положительной и отрицательной интерференции, зависимой от дозы биотина (табл. 3).

Однако когда речь идет об очень высокой концентрации биотина, например при рассеянном склерозе, интерференция в равной степени будет отмечаться в каждом конкурентном и «сэндвич»-тесте, о чем свидетельствуют недавние клинические случаи [2, 3] (см. табл. 3). При назначении разных иммунохимических исследований на тест-системах, имеющих в основе взаимодействие биотин—стрептавидин, можно ожидать множества некорректных результатов: в одном из недавних случаев, связанных с применением мегадоз биотина, отмечена интерференция при измерении 12 различных аналитов, как на конкурентных тест-системах, так и на системах типа «сэндвич» [3].

Измерение сывороточной концентрации свободного биотина проводилось в следующем одном случае: свободный биотин оценивали у пациента с терминальной хронической почечной недостаточностью, получавшего 10 мг биотина [5]. Концентрация свободного биотина составила 4,8 мкг/л, т. е. 19,6 нмоль/л, и привела к явно некорректной оценке концентрации ПТГ: 48 пг/мл вместо 786 пг/мл. Неожиданный результат — учитывая, что, согласно описанию реагента, интерференция могла произойти только при превышении сывороточной концентрации биотина 205 нмоль/л (см. табл. 2, тест ПТГ, «Roche»). Это может быть связано с метаболитами (такими, как биснорбиотин, биотинсульфоксид [10]) и/или биотинилированными in vivo соединениями, которые также могут влиять на результаты исследования [5]. На самом деле известно, что производные биотина могут связываться с авидином, хотя связь будет слабее [10]. Поэтому исследование сывороточного свободного биотина не позволяет адекватно оценить степень ошибки [5]. По той же причине эксперименты с добавлением свободного биотина in vitro не могут корректно отразить диапазон ошибок, которые отмечаются у пациентов, получавших биотин.

Основным путем экскреции биотина (как интактного, так и метаболизированного) являются почки [10]. Кривая зависимости ответа от времени показала, что изменение результатов иммунохимического исследования было максимальным через 2ч после приема 30 мг биотина и сохранялось вплоть до 25 ч [13]. Как и ожидалось, временной интервал был более продолжительным при приеме биотина в дозе 300 мг у неврологических пациентов с расчетным периодом полувыведения 7,8—18,8 ч и средней максимальной концентрацией биотина 823±303 мкг/л (3374±1242 нмоль/л) [15]. В случае повторного приема аккумуляции биотина в крови не ожидается. M. Elston и соавт. [3] наблюдали нормализацию результата Т₄св через 3 дня после прекращения приема 300 мг биотина. Время, необходимое для снижения концентрации биотина до уровня, совместимого с результатами других тестов, неизвестно.

При хронической болезни почек влияние биотина на результаты анализов может усиливаться. В случае терминальной почечной недостаточности результат ПТГ оставался ошибочным до 15 дней после отмены приема биотина в дозе 10 мг [5].

Поэтому, как рекомендуют некоторые производители [8], желательно прекратить прием биотина перед взятием крови, предпочтительно за 24 ч и более. Эта предосторожность может быть достаточна при самолечении биотином, но не поможет при приеме высоких доз, предписанных при неврологических заболеваниях, или в случае заболевания почек. К сожалению, в случае парентерального питания затруднительно вывести биотин из раствора для внутривенного применения.

Таким образом, связь между суточной дозой биотина, концентрацией биотина в сыворотке и временем взятия проб, с одной стороны, и степенью интерференции — с другой заслуживает дальнейшего изучения. Для исключения некорректного результата рекомендуется следовать специальным протоколам времени взятия крови при различных клинических ситуациях, связанных с биотином.

Тот же механизм интерференции можно ожидать при наличии в сыворотке антистрептавидиновых антител [16, 17]. В отличие от биотина эта интерференция эндогенна и ее эффект не сглаживается со временем: учитывая возможность продолжительной интерференции, необходимо предупредить пациента о потенциальном влиянии этих антител на результаты будущих медицинских осмотров и риске некорректного лечения или обследования [16]. Распространенность этих антител может быть очень мала, но ее еще требуется оценить. Механизм появления этих антител до сих пор не ясен. Стрептавидин продуцируется Streptomyces avidinii, и неизвестно, какие обстоятельства могут привести к иммунизации.

В зарегистрированных случаях более выраженный эффект наблюдался в конкурентном тесте, чем в «сэндвич»-тесте: например, концентрации Т₃св и Т₄св будут завышены, тогда как концентрация ТТГ может быть снижена, но подавляться полностью не будет, как произошло бы в случае реального гипертиреоза. Отсутствие подавления выработки ТТГ и резкий подъем концентраций тиреоидных гормонов будут замечены и отнесены к синдрому неадекватной секреции тиреотропина, как сообщалось в данных случаях [4, 16, 17] (табл. 4).

Возможность интерференции можно заподозрить по различным признакам [18]:

— несоответствие результатов клинической картине, например тиреотоксический лабораторный профиль у пациента с клиническим эутиреозом. Аномалии могут распространяться на несколько других эндокринных исследований, что усилит подозрение об интерференции [3];

— сравнение физиологически зависимых переменных: дисбаланс между концентрацией гормона и его регулирующего фактора, например вызывающий мысли об очень редком синдроме неадекватной секреции ТТГ [8, 16, 17];

— крайне необычная концентрация аналита;

— значительная разница в результатах, полученных при использовании различных аналитических методов: как упоминалось выше, эти ошибки зависят от методики исследования, так как влияют только на иммунохимические тест-системы на основе взаимодействия стрептавидин—биотин.

При подозрении на интерференцию используются лабораторные тесты для поиска гетерофильных антител. Интерференция гетерофильных антител известна в течение нескольких десятилетий. Они могут повлиять на любой иммунохимический тест [19], хотя в большинстве случаев интерференция обнаруживается в «сэндвич»-тестах, вызывая ложноположительный результат [20], в отличие от интерференции с биотином. Чрезвычайно редко сообщалось об ошибочных результатах сразу нескольких исследований на гормоны вследствие интерференции гетерофильных антител [20, 21]. Хотя интерференция биотина менее известна, она также вызывает беспокойство, поскольку благодаря ей может быть получен патологический гормональный профиль из-за множественных некорректных результатов, как ложноположительных, так и ложноотрицательных, что может привести к назначению некорректной терапии.

Для выявления аналитической проблемы может быть проведено исследование интерференции. Линейность может быть проверена с помощью теста на разведение при условии, что существует соответствующий разбавитель [16]. Результат иммунохимического теста должен сохранять достоверность при использовании разведенного образца. Некоторые иммунохимические тесты не могут применяться на разведенных образцах из-за матрикс-эффекта или «резистентности» к разведению, например исследование свободных фракций тиреоидных гормонов [22]. Если разведение осуществимо, тест на разбавление продемонстрирует отрицательную интерференцию (более высокие концентрации в разбавленном образце, чем в неразбавленном образце при «сэндвич»-тесте) и/или положительную интерференцию (наоборот, заниженная концентрация в разбавленном образце при конкурентном формате тестирования). За исключением биотина, который является экзогенным фактором (и может быть подтвержден запросом у пациента или лечащего врача), точная идентификация влияющего фактора может потребовать узкоспециализированных лабораторных исследований.

Нейтрализацию биотина (или антител к стрептавидину) можно обеспечить с помощью стрептавидиновой твердой фазы большой емкости, способной «блокировать» интерференцию [5, 16]. Результаты, полученные после удаления влияющего фактора, не подлежат учету и указывают только на то, что исходные значения ненадежны.

Интерференция биотина специфична для методики исследования, и ее можно выявить при применении альтернативного метода (значительное отличие результатов, полученных на другой аналитической системе).

Появление такого рода интерференции и рост ее распространенности побудил производителей реагентов пересмотреть свои тест-системы с целью минимизации риска появления ошибочных результатов. Эти попытки, надеемся, будут успешными; они могут включать модифицированные протоколы исследования, дизайн которых предотвращает нарушение формирования иммунных комплексов (например, G. Barbesino [2] смог получить нормальную концентрацию глобулина, связывающего половые гормоны, у пациента, получавшего 300 мг биотина, хотя в этом тесте использовалось взаимодействие стрептавидин—биотин, тогда как результаты всех остальных исследований оказались сильно искажены).

Помогут ли методы не иммунохимического анализа избежать таких «подводных камней»? К сожалению, очень мощные и надежные измерения, такие как метод жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС), еще не адаптированы к высокой производительности, сопоставимой с иммунохимическими тест-системами. Кроме того, ЖХ/МС/МС представляет собой сложную методику, которая требует достаточно высокого уровня технической подготовки персонала лаборатории. Хотя ЖХ/МС/МС во всем мире все чаще используется для анализа небольших молекул, таких как стероиды и метаболиты витамина D, маловероятно, что в обозримом будущем она заменит аналитические методы оценки крупных молекул (такие, как «сэндвич»-тесты на гликопротеины). Поэтому иммунохимические «сэндвич»-тесты, несмотря на их недостатки, по-прежнему будут широко использоваться, по крайней мере в ближайшие годы.

Клиническая и терапевтическая информация имеет решающее значение — она помогает заподозрить и выявить подобные случаи интерференции. В частности, понятие о биотиновой терапии (включая парентеральное введение) стало ключевым вопросом: в настоящее время клиницисты должны активно и настойчиво выяснять у своего пациента, употребляет ли он биотин [2, 8]. Желательно, чтобы лаборатории систематически предупреждали о возможном воздействии биотина при предоставлении результатов тестирования. В идеале хотелось бы, чтобы медицинские информационные системы могли автоматически генерировать флаг, сигнализирующий о приеме пациентом биотина, для предупреждения лабораторий [11].

Благодаря простой и быстрой автоматизации тестирования множества гормонов эти исследования широко используются в здравоохранении. Иногда при анализе некоторых образцов сыворотки могут возникать ошибки, которые необходимо тщательно исследовать для улучшения технологий иммунохимического тестирования. Лабораториям (а также исследовательским группам) следует знать о возможности подобных случаев, в частности о влиянии биотина, прием которого может привести к получению ложноположительных и ложноотрицательных результатов на иммунохимических тест-системах, в основе которых лежит взаимодействие стрептавидин—биотин. Следует учитывать и другие возможности появления ложноотрицательных и ложноположительных результатов, в случае если происходит подавление измеряемого сигнала [23].

Исследования на возможную интерференцию, которые могут проводиться в любой лаборатории, включают тестирование на линейность, повторное тестирование после отмены биотина и подтверждение результата с помощью альтернативного метода. Поскольку разнообразие доступных методов снижается при использовании высокопроизводительных аналитических платформ, обращение к альтернативному методу может быть затруднено; тем не менее он должен оставаться легкодоступным. Следует опасаться роста распространенности интерференции биотина из-за широкого использования технологии и все более частого применения его в дозах, превышающих физиологические.

Высокая встречаемость заболеваний щитовидной железы и частое обращение пациентов для оценки ее функции привлекли внимание к интерференции с биотином. Однако эта интерференция проявляется не только при исследованиях гормонов щитовидной железы. Хотя тесты на Т₄св, ТТГ и Т₃св кажутся особенно подверженными такого рода интерференции, еще одной тревожной областью являются исследования ПТГ и фосфорно-кальциевого обмена [4, 5, 7].

Несмотря на улучшение технологий иммунохимического тестирования, проблему нежелательной интерференции еще предстоит решить. Критический подход к результатам гормональных исследований, а также открытая и постоянная связь между персоналом лаборатории и клиницистами остаются лучшей стратегией, позволяющей избежать некорректной терапии из-за непредвиденной интерференции.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*Оригинал статьи: Marie Liesse Piketty, Michel Polak, Isabelle Flechtner, Laura Gonzales-Briceno, Jean Claude Souberbielle. False biochemical diagnosis of hyperthyroidism in streptavidin-biotin-based immunoassays: the problem of biotin intake and related interferences. Clin Chem Lab Med. 2017 May 1;55(6):780-788.

https://doi.org/10.1515/cclm-2016-0606

Перевод В.Ф. Тютюнина. Редактор перевода А.В. Мошкин

Статья была переведена с разрешения De Gruyter publishers. De Gruyter не несет ответственности за точность перевода. Воспроизведено из журнала Clin Chem Lab Med 2017;55:189-194, с разрешения De Gruyter. © 2017 De Gruyter.

Просьба при цитировании этой статьи ссылаться на оригинальный источник публикации.