Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) — опухолевые клональные заболевания миелоидного ростка кроветворной системы с первичным поражением костного мозга. По данным 2010 г., частота заболеваемости ОМЛ в Москве составила 2,9 случая на 100 тыс. населения [1], медиана возраста больных — 65 лет [2].

Для верификации диагноза больным проводили морфологическое, цитохимическое исследование костного мозга, иммунофенотипирование и цитогенетический анализ. Миелограмма показала увеличение бластных клеток (в соответствии с рекомендациями ВОЗ — более 20%) с одновременным угнетением пролиферации элементов эритропоэза и мегакариоцитопоэза [3, 4]. В зависимости от возраста пациента и наличия тяжелой сопутствующей патологии назначали или высокоинтенсивную индукционную терапию (схема «7+3») или низкоинтенсивную терапию (низкодозный цитарабин и гипометилирующие агенты). Ответ оценивали на 21—28-й день после начала терапии либо на момент восстановления показателей периферической крови (абсолютное число нейтрофилов более 1,0·10⁹/л, тромбоцитов более или равное 100·10⁹/л). В момент констатации полной клинико-гематологической ремиссии в костном мозге морфологически определяется менее 5% бластов. В этом случае пациенту в дальнейшем проводят несколько курсов высокодозной консолидации для закрепления результата. По международным критериям резистентность при ОМЛ можно оценивать лишь через 7 дней после завершения химиотерапии. При отсутствии полной ремиссии после завершения двух курсов индукционной терапии констатируется резистентная форма ОМЛ и проводятся последующие попытки индукции.

Цель настоящего исследования — оценка элиминации бластных клеток и степень восстановления костного мозга после химиотерапии с помощью современных технологий автоматизированного анализа.

В период с апреля по декабрь 2017 г. проведены исследования у 27 пациентов 6-го гематологического отделения ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина (зав. отд. — Н.К. Хуажева) с первично выявленным (за исключением М3-варианта) ОМЛ. Трем пациентам, имеющим исходный уровень лейкоцитов более 100·10⁹/л, перед циклом индукции проводили предподготовку путем введения препарата гидроксимочевины. В качестве индукционной терапии у 20 (74%) больных применена схема «7+3», у 3 (11%) — малые дозы цитозара в течение 10 дней, у 4 (15%) — гипометилирующие агенты. По результатам клинического исхода (ответ на первый курс химиотерапии) все пациенты были разделены на две группы. В 1-ю группу вошли 14 пациентов (10 женщин и 4 мужчины в возрасте от 24 до 83 лет), у которых была достигнута полная ремиссия. Во 2-ю группу — 13 пациентов (4 женщины, 9 мужчин в возрасте от 37 до 79 лет), у которых констатировали резистентную форму ОМЛ после завершения двух курсов индукционной терапии. У пациентов с полной ремиссией проведены либо высокодозные консолидирующие курсы по различным схемам (НАМ, HD Ara-C, «7+3»), либо продолжена низкоинтенсивная терапия. Данные пациенты выделены в 3-ю группу пациентов. У 6 из 14 пациентов при проведении высокодозной консолидации на 7-й день после окончания химиотерапии был введен гранулоцитарный колониестимулирующий фактор с целью ускорения восстановления числа нейтрофилов. У всех пациентов кровь анализировали до назначения каких-либо препаратов. При проведении первого индукционного курса у большинства пациентов пробы исследовали в динамике на 1, 4—6, 7—8, 15—16, 21—23 и 28—35-й дни с начала химиотерапии. При проведении курса консолидации к предыдущим точкам измерения добавляли еще одну пробу на 36—43-й день. Исследования ретикулярных тромбоцитов на первом цикле индукции в связи с техническими трудностями были проведены только во 2-й группе.

У всех больных проводили исследование венозной крови, взятой натощак в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К₂-ЭДТА производства фирмы «Becton Dickinson». Общий анализ крови выполняли на гематологических анализаторах ADVIA 2120/2120i («Siemens», Германия) и CELL-DYN Sapphire («Abbott Lab. S.A.»). На анализаторах Advia 2120/2120i разделение лейкоцитов на субпопуляции осуществляется в зависимости от содержания в них миелопероксидазы (МПО; определяется по величине клеточной абсорбции) и их размера (определяется по величине прямого светорассеивания). Помимо классических пяти популяций лейкоцитов, на скатерограмме выделяется так называемая LUC (large unstained cells) область МПО-негативных крупных клеток. По данным литературы [5—8], в эту популяцию входят бластные клетки, большие гранулярные лимфоциты и/или другие крупные пероксидазо-отрицательные клетки. Для оценки восстановления тромбоцитарного звена гемопоэза использовали параметр %rP (ретикулярные тромбоциты), представленный в анализаторе CELL-DYN Sapphire фирмы «Abbott Lab.» и отражающий число незрелых тромбоцитов. Цитохимическое определение числа МПО-позитивных бластных клеток осуществляли с использованием наборов Диахим-Цитостейн-МПО производителя «НПФ-Абрис +». Для оценки элиминации бластов кровь исследовали методом проточной цитометрии с использованием набора моноклональных антител CYTODIFF на приборе Cytomics FC500 («Beckman Coulter», США).

Набор CYTODIFF представляет 5-цветный коктейль из 6 моноклональных антител CD36-FITC/CD2-PE/ CD294+(CRTH2)-PE/CD19-ECD/ CD16-Cy5/ CD45-Cy7, который позволяет подсчитать 17 клеточных субпопуляций. Бластные клетки выделяются в регионах, обозначенных как Xt (Т-бласты), Xb (В-бласта), Xn (миелобласты), Xm (монобласты). Для выделения всех вышеуказанных популяций в проточном цитометре Cytomics FC500 («Beckman Coulter») используется программа автоматического гейтирования клеточных популяций (CytoDiff CXP 2.0; «Beckman Coulter, Miami, FL», США) [9].

Для статистического анализа результатов исследования применяли программу GraphPad Prism («GraphPad Software, Inc.», США). Из-за малочисленности групп при их сравнении использовали непараметрические критерии Манна—Уитни для двух независимых групп и тест Фрэйдмана для трех зависимых групп и более. Различия считали достоверными при p<0,05.

В 1-й группе исходный средний процент МПО-позитивных бластов составил 51,78%, что статистически значимо превышало это значение во 2-й группе (9,3%) с вероятностью p=0,002 (рис. 1).

На гематологическом анализаторе ADVIA 2120/2120i бластные клетки пациентов 1-й группы с количеством МПО-позитивных бластов более 65% локализовались на скатерограмме в регионе моноцитов (МПО +) и/или нейтрофилов (МПО+++). В то же время у пациентов 1-й группы с количеством МПО-позитивных бластов менее 30% и у всех больных 2-й группы бластные клетки локализовались в LUC-области (МПО–). Относительное количество LUC-клеток имело обратную зависимость с числом МПО-позитивных бластов. У 4 пациентов 1-й группы с количеством МПО-позитивных бластов менее 30% и у всех больных 2-й группы отмечено низкое абсолютное количество нейтрофилов и высокое значение %LUC. В то же время 5 пациентов 1-й группы с количеством МПО-позитивных бластов более 65% имели высокое абсолютное число нейтрофилов и низкий %LUC. Данные проиллюстрированы в табл. 1.

Данные изменения параметров %Xn, лейкоцитов, абсолютного и относительного числа ретикулоцитов, тромбоцитов и %rP в динамике проведения химиотерапии представлены в табл. 2.

До введения цитотоксических препаратов относительное количество Xn миелоидных бластов при исследовании на проточном цитометре достоверно не отличалось в обеих группах. При оценке динамики параметра %Xn в 1-й группе отмечено достоверное снижение показателя уже на 7−8-й день проведения химиотерапии (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем. В последующие дни наблюдали дальнейшее понижение показателя, который достиг своего минимума на 28—35-й день. Во 2-й группе %Xn достоверно не изменился и остался на уровне 44,65% на 4—6-й день и 15,76% на 28—35-й день проведения цикла индукции. Для удобства интерпретации результатов был рассчитан коэффициент элиминации бластов в каждой точке. Формула расчета коэффициента элиминации бластов:

где m — день цикла химиотерапии.

График оценки скорости элиминации бластов на основе коэффициента элиминации представлен на рис. 2.

В 1-й группе исходное количество лейкоцитов до лечения с вероятностью р=0,09 превышало таковое во 2-й группе. После начала введения гидроксимочевины значение лейкоцитов достоверно уменьшилось (р=0,011).

Исходные значения эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов в обеих группах были значительно ниже референсных пределов и достоверно не отличались друг от друга (рис. 3).

Изменения относительного числа LUC в ходе химиотерапии в 1-й и 2-й группах представлены на рис. 5.

Достоверные изменения абсолютного числа нейтрофилов отмечены только в 1-й группе больных с количеством МПО-позитивных бластов более 65% и во 2-й группе на 15—16-й день химиотерапии (рис. 6).

В обеих группах лейкоциты и тромбоциты достоверно снижались на 7—8-й день проведения химиотерапии (p<0,05), достигая своего минимума на 15—16-е сутки с последующим увеличением параметра. На 28—35-й день лейкоциты и тромбоциты достоверно восстановились до уровня нормальных значений только в 1-й группе. В конце восстановительного периода значения лейкоцитов и тромбоцитов в группе с полной ремиссией были достоверно выше (р<0,01), чем в группе с резистентным течением (см. табл. 2). Значение rP в ходе химиотерапии колебалось во 2-й группе. Увеличение показателя отмечено на 7—8-й день с дальнейшим снижением на 15—16-й день и ростом на 21—23-й день после начала химиотерапии. Конечное значение ретикулярных тромбоцитов соответствовало 3,60% на 28—35-й день. Однако достоверных изменений rP не выявлено.

В обеих группах не выявлено достоверно значимого изменения числа эритроцитов и количества гемоглобина в ходе проведения первого цикла химиотерапии. Однако в обеих группах наблюдали достоверное снижение абсолютного и относительного количества ретикулоцитов на 7—8-й день проведения химиотерапии с минимумом на 15—16-е сутки с последующим увеличением параметра (см. рис. 3). В 1-й группе на 28—35-й день после начала цикла индукции произошло достоверное увеличение абсолютного и относительного числа ретикулоцитов выше нормальных пределов (р<0,05). Во 2-й группе достоверных изменений не выявлено. Таким образом, в группе полной клинико-гематологической ремиссии произошло восстановление двух ростков гемопоэза и отмечена тенденция к восстановлению эритроидного ростка в отличие от группы с резистентным течением.

При проведении дальнейших циклов консолидации ремиссии в 1-й группе количество лейкоцитов и тромбоцитов на 7—8-е сутки проведения химиотерапии (p<0,05) достоверно снижалось с достижением своего минимума на 15—16-е сутки с последующим достоверным увеличением параметров. Однако в отличие от цикла индукции достоверное восстановление лейкоцитов и тромбоцитов до нормальных значений произошло позже, на 36—48-й день (см. табл. 2). Уровень восстановления лейкоцитов и тромбоцитов после цикла индукции и консолидации достоверно не отличался. При оценке динамики rP в ходе цикла консолидации можно отметить достоверное повышение показателя на 15—16-й день с последующим снижением на 21—23-й день (рис. 7).

Больные ОМЛ отличаются по количеству МПО-позитивных бластов. В нашей предыдущей статье при сравнительном исследовании метода выявления бластов по параметру %LUC на гематологическом анализаторе ADVIA 2120/2120i с морфологической оценкой было показано, что бластные клетки могут регистрироваться на скатерограмме в разных регионах как в LUC-области (с числом МПО-позитивных бластов менее 35%), так и в регионе моноцитов или нейтрофилов (с количеством МПО-позитивных бластов более 65%) [7]. Поэтому первичная диагностика и оценка элиминации бластов невозможны без микроскопического исследования. Результаты исследования M. Depoorter [8] показали чувствительность выявления бластов по параметру %LUC, равную 90%, специфичность — 41%. По результатам наших исследований, чувствительность анализатора к выявлению бластов на основе параметра %LUC составила 52%, специфичность — 47%. Нами было показано, что только у больных с числом МПО-позитивных бластных клеток менее 35% можно оценить динамику элиминации бластов на основе показателя LUC. В противоположность параметру LUC показатель %Xn, исследуемый с помощью реагентов CYTODIFF, позволяет оценить элиминацию бластов независимо от количества МПО-позитивных бластов, что согласуется с результатами нашей предыдущей работы [7]. У всех пациентов с ОМЛ бластные клетки регистрировались в области Xn-бластов (миелобластов), r_s=0,784. С помощью выведенной нами формулы уже на 4—6-й день проведения индукционного курса химиотерапии возможно прогнозировать ответ пациента на химиотерапию. Достоверное снижение этого показателя более чем в 2 раза свидетельствовало о хорошем ответе на химиотерапию. По данным J. Kahng и соавт. [10], метод CYTODIFF обладает высокой чувствительностью (94,4%) и специфичностью (91,9%) и хорошо коррелирует с ручным подсчетом бластных клеток (r=0,922). Результаты нашего исследования показали чувствительность метода CYTODIFF к выявлению бластов на основе параметра %Xn 85%, специфичность 100%.

Абсолютное количество нейтрофилов в восстановительный период (более 15 дней) достоверно не изменилось ни в одной группе. Следует отметить, что в группе больных с количеством МПО-позитивных бластов более 65% контроль за восстановлением нейтрофилов на гематологическом анализаторе ADVIA 2120/2120i невозможен без дополнительного микроскопического исследования, так как бластные клетки локализуются на скатерограммах в области нейтрофилов [7].

Изначальное среднее количество лейкоцитов было в пределах нормальных значений в обеих группах, что, вероятно, вызвано высоким уровнем бластоза у пациентов. После введения гидроксимочевины количество лейкоцитов достоверно снизилось. Исходные значения эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов в обеих группах были значительно ниже нормальных пределов и достоверно не отличались друг от друга, что может свидетельствовать об ингибирующем влиянии опухолевой массы на стромальное микроокружение в костном мозге и вытеснении эритроидного и тромбоцитарного ростков гемопоэза.

При проведении как циклов индукции, так и консолидации минимальные показатели всех трех ростков наблюдались на 15—16-й день. Только абсолютное и относительное число ретикулоцитов при проведении цикла консолидации показало минимальные значения на 7—8-й день химиотерапии. Далее происходило увеличение количества лейкоцитов и тромбоцитов, абсолютного и относительного числа ретикулоцитов, достигая полного восстановления только в группе с полной ремиссией на 28—35-й день после индукционного курса и на 36—48-е сутки после цикла консолидации ремиссии. Таким образом, период восстановления показателей оказался длиннее на 7—10 дней при проведении цикла консолидации, что, вероятно, связано с тем, что консолидация ремиссии — это наиболее агрессивный и высокодозный этап при лечении ОМЛ и костному мозгу необходимо более продолжительное время для регенерации, чем после цикла индукции ремиссии. По данным U. Malkan и соавт. [11, 12], нормализация уровня тромбоцитов после химиотерапии является независимым предиктором хорошего прогноза при лечении ОМЛ. Увеличению тромбоцитов предшествовало повышение rP, что не расходится с результатами работ P. Stohlawetz и соавт., G. Yamaoka и соавт. [13, 14]. Достоверное увеличение rP на 15—16-й день от начала цикла было выявлено только в ходе проведения консолидации, что предшествовало восстановлению тромбоцитов на 7—10-й день. Уровень эритроцитов и гемоглобина изменялся только при проведении консолидации, достоверно снижаясь на 15—16-й день химиотерапии. Однако при проведении как индукции, так и консолидации уровень эритроцитов и гемоглобина оставался ниже нормальных значений. Вероятно, это связано с длительным восстановлением эритроидного ростка в отличие от гранулоцитарного и тромбоцитарного ростков, которые восстанавливаются за 10—14 дней. У больных, вышедших в полную клинико-гематологическую ремиссию, уровень ответа костного мозга выше и способность к регенерации больше, чем у пациентов с резистентной формой ОМЛ.

Таким образом, современные технологии автоматизированного анализа крови позволяют проводить оценку восстановления костного мозга после окончания химиотерапии, оценку элиминации бластных клеток при проведении химиотерапии в ситуациях глубокой цитопении, когда морфологический контроль невозможен, что может использоваться в клинической практике. Применение данных методов может оказать существенную помощь в оценке прогноза ответа пациента на химиотерапию ОМЛ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:koann@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7422-7476