Исследование связи полиморфизма С3435Т и экспрессии мРНК гена MDR1 с уровнем накопления даунорубицина в лейкоцитах пациентов при хронических миелопролиферативных заболеваниях

Эффективность терапии онкологических заболеваний лимитируется развитием множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток к широкому ряду лекарственных препаратов. Ген множественной лекарственной устойчивости — MDR1 кодирует синтез белка трансмембранного АТФ-зависимого переносчика ксенобиотиков — Р-гликопротеина (Pgp). Среди веществ, транспортируемых из цитоплазмы в межклеточную жидкость Pgp-переносчиком, описаны фармакологические средства терапии хронического миелолейкоза (ХМЛ) и Ph-негативных миелопролиферативных новообразований (ХМН) [1]. Показано также, что слабый полиморфизм C3435T гена MDR1 ассоциирован с более высоким риском развития онкогематологических заболеваний: острых лейкозов [2] и ХМЛ [3, 4]. В различных этнических группах было продемонстрировано влияние полиморфизмов MDR1 на развитие резистентности к терапии ХМЛ иматинибом [3—9]. Было также предложено первичное использование второй линии препаратов, устойчивых к Pgp-эффлюксу, вместо иматиниба у пациентов с полиморфизмами высокого риска резистентности [9].

Вместе с тем только в одной работе I. Ben Hassine и соавт. [4] изучался возможный молекулярный механизм влияния полиморфизмов на развитие резистентности к иматинибу. При этом сдвигов уровня экспрессии мРНК гена MDR1 при изученных вариантах носительства его генетических полиморфизмов не обнаружено.

Влияние полиморфизмов гена MDR1 на непосредственную функцию переносчика в клетках крови пациентов с миелопролиферативными заболеваниями ранее не изучалось. Учитывая возможности проточной цитометрии, можно надеяться на перспективу внедрения функциональных тестов, отражающих процесс накопления цитостатиков в клетках-мишенях, максимально приближенный к условиям in vivo. Известно, что в число субстратов переносчика Pgp входит и широко используемый цитостатик даунорубицин [1]. Ранее нами был описан цитометрический метод определения интенсивности накопления даунорубицина клетками крови как критерий функционирования эффлюкса ксенобиотиков у здоровых добровольцев [10].

Цель настоящего исследования — оценка уровня накопления даунорубицина в лейкоцитах крови пациентов с ХМЛ и ХМН и исследование возможной связи этого показателя с полиморфизмом C3435T гена MDR1 и уровнем экспрессии мРНК гена MDR1.

Предметом исследований являлись пробы периферической крови 67 пациентов с ХМЛ в хронической фазе заболевания и 128 пациентов с ХМН, из них 74 — с истинной полицитемией, 34 — с эссенциальной тромбоцитемией, 17 — с миелофиброзом, а также 3 пациента с наследственным эритроцитозом. Пробы крови 92 здоровых добровольцев были включены в контрольную группу. Исследование носило анонимный наблюдательный характер и не предусматривало дополнительных инвазивных манипуляций. Венозную кровь отбирали стандартным методом в одноразовые вакуумные пробирки с цитратом натрия. Лейкоциты выделяли с использованием лизирующего раствора FACS Lysing Solution (BD «Biosciences», США). Полученную взвесь лейкоцитов дважды отмывали PBS и для дальнейших исследований сохраняли их не более 45 мин при 37 ^oC в среде с PBS, содержащей 1% ЭТС, глутамин. В качестве субстрата Pgp использовали даунорубицин в концентрации, эквивалентной его терапевтической дозе (1 мкг/мл). При интерпретации результатов мы исходили из того, что уровень накопления даунорубицина в клетках можно расценивать как показатель работы белков-переносчиков, препятствующих диффузионному потоку этих веществ из внешней среды в клетку. Чем более активны транспортные системы, тем больше веществ выбрасывается из цитоплазмы и соответственно меньше их накапливается в клетках. Уровень накопления даунорубицина в лимфоцитах и нейтрофилах измеряли на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II в красной области спектра (полоса пропускания 620 нм) при длине возбуждения 488 нм. Внутриклеточную концентрацию даунорубицина выражали в условных единицах как отношение уровня флюоресценции к размеру клеток (сигнал канала FSC). Аналитический разброс (коэффициент вариации) оцениваемых нами цитометрических параметров при анализе сопоставимости 10-кратных повторных измерений пробы крови от одного пациента составил от 3,9 до 7,7%.

Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с помощью набора ДНК-Сорб-В (ООО «Интерлабсервис», Россия), выделение РНК проводили набором Рибо-золь Д (ООО «Интерлабсервис», Россия). Для определения полиморфизма C3435T (rs1045642) гена MDR1 был использован ранее описанный метод [11]. Экспрессию мРНК гена MDR1 определяли аллель-специфической ПЦР по отношению к суммарной экспрессии генов домашнего хозяйства ABL, TBP и GUS. Молекулярно-генетические тесты проводили с использованием наборов ГенЭкспресс MDR1 (ООО «Формула гена», Красноярск).

Статистическую обработку полученных данных проводили в аналитической среде R [12]. Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса и критерия Шапиро—Уилка показала, что полученные данные не подчиняются закону нормального распределения, поэтому для дальнейшего анализа использовали непараметрические методы статистики. Значимость отличий вариационных рядов в несвязанных выборках оценивали с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни и с помощью критерия Краскела—Уоллиса при сравнении более двух групп, различия оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Данные, представление в табл. 1, не

В соответствии с данными, представленными на рис. 1, видно,

Вместе с тем уровень экспрессии мРНК гена MDR1, напротив, снижался в лейкоцитах венозной крови пациентов (рис. 2).

Отсутствие влияния отдельного полиморфизма C3435T (rs1045642) гена MDR1 на риск развития хронических миелопролиферативных заболеваний или развития резистентности к иматинибу в целом согласуется с опубликованными ранее данными о важности одновременной оценки носительства комплекса наиболее информативных однонуклеотидных замен как в гене MDR1, так и в других генах, определяющих распределение и метаболизм ксенобиотиков [3—9], а также репарацию повреждений ДНК [3].

Отсутствие сдвигов в экспрессии мРНК гена трансмембранного транспортера ABCB1 (MDR1) у пациентов с ХМЛ — носителей разных вариантов полиморфизмов данного гена было продемонстрировано ранее в работе I. Ben Hassine и соавт. [4]. Очевидным выводом из анализа этих результатов является заключение об отсутствии увеличенного синтеза белка-переносчика Pg как причины развития резистентности пациентов с ХМЛ к иматинибу. Вероятно, изучаемые полиморфизмы данного гена допускают большую функциональную эффективность работы переносчика без увеличения абсолютного количества белковых молекул.

В нашей работе мы впервые провели сравнение экспрессии мРНК гена MDR1 у пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями и выявили обратную зависимость от накопления даунорубицина в клетках крови. Конкретные причины выявленного расхождения между уровнем накопления даунорубицина в клетках и экспрессией гена MDR1 требуют дальнейшего изучения.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что механизмы накопления даунорубицина в лейкоцитах крови пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями не зависят от активности экспрессии гена-переносчика Pgp и могут быть также обусловлены иными системами трансмембранного транспорта или более интенсивным метаболизмом цитостатика, снижающим его флюоресцентную активность.

Вместе с тем данные проточной цитометрии по накоплению цитостатика свидетельствуют о широкой индивидуальной вариации показателей. Это позволяет надеяться на перспективы внедрения функциональных тестов, отражающих индивидуальные процессы транспорта и метаболизма лекарственных препаратов в онкотрансформированных и интактных клетках крови с целью подбора наиболее оптимального терапевтического препарата и режима его использования.

Использование проточной цитометрии выявило значимое снижение интенсивности накопления даунорубицина гранулоцитами и лимфоцитами венозной крови пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями. Одновременно в лейкоцитах большинства пациентов наблюдается снижение экспрессии мРНК гена MDR1. В работе не обнаружено значимого влияния полиморфизма C3435T гена MDR1 на параметры накопления даунорубицина клетками крови пациентов. Данный полиморфизм не влияет на риск развития ХМН и ассоциирован с риском ХМЛ и развитием резистентности пациентов к иматинибу лишь на уровне статистической тенденции. Повышение информативности лабораторной оценки прогноза развития заболевания и резистентности к терапии требует разработки комплекса молекулярно-генетических и функциональных тестов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:krashemcenter@mail.ru; https://orcid.org /0000-0003-2311-2219