Влияние преаналитического этапа на стабильность аналитов биохимического профиля

Авторы:
  • Д. П. Пискунов
    Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург, Россия
  • А. С. Пушкин
    Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия; СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2», Санкт-Петербург, Россия
  • С. А. Рукавишникова
    Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия; СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2», Санкт-Петербург, Россия
  • Т. А. Ахмедов
    Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия; СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница №2», Санкт-Петербург, Россия
Журнал: Лабораторная служба. 2017;6(4): 24-30
Просмотрено: 473 Скачано: 30

В эпоху персонализированной медицины именно лабораторные исследования имеют жизненно важное значение для диагностики, прогнозирования и терапевтического мониторинга заболеваний человека [1]. В частности, результаты биохимического анализа крови важны для оценки состояния различных систем организма, а недостоверные результаты могут ввести в заблуждение врача-клинициста. Несмотря на достижения, которые, несомненно, позволили достичь гораздо более высокого уровня качества при диагностическом тестировании, многие проблемы по-прежнему остаются нерешенными, особенно на преаналитическом этапе, начиная с постановки тестов до получения и хранения биологических образцов [2, 3].

В настоящее время наблюдается тенденция к централизации лабораторных исследований [4]. Такая лабораторная деятельность характеризуется высокой пропускной способностью и коротким временем выполнения тестов, но транспортировка биологических материалов остается важной, часто так и не решенной проблемой [5]. Актуальной задачей является контроль стабильности исследуемых аналитов при их хранении ввиду его влияния на конечный результат лабораторного исследования.

К идее проведения настоящего исследования авторов побудил научный эксперимент, опубликованный в 1981 г. в журнале Clinical Chemistry [6], а позже неоднократно цитированный отечественными и зарубежными исследователями [7, 8]. Авторы данной публикации провели исследование влияния температуры и длительности хранения на значения 25 аналитов. Образцы хранили при температуре 4, 23 и 30 °C, проводя измерения через 2, 4, 6, 8, 24 и 48 ч, не отделяя при этом клеточный компонент крови. Учитывая давность публикации и несовершенство преаналитического этапа того времени, нами была предпринята попытка повторить эксперимент, но с учетом современных технологий.

Кроме того, мы поставили задачу определить важность влияния клеточного фактора на стабильность аналитов в сыворотке крови человека, для чего мы отделили клеточный компонент у проб 1-й группы.

Важно понимать, какие условия хранения и транспортировки оказывают клинически значимое изменение аналита. По мнению ряда авторов, большáя часть инструкций и другая справочная литература часто не содержат подробной информации относительно влияния внешних и внутренних факторов на пробы во время преаналитического этапа и требуют адаптации к реальным условиям [9].

Цель исследования — оценить стабильность аналитов крови человека при влиянии различных температурных режимов и длительности хранения, а также наличия форменных элементов крови.

Материал и методы

Исследование проводили на базе клинико-диагностической лаборатории СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2». В ходе исследования отобрано 60 образцов крови от 30 пациентов в возрасте от 40 до 94 лет, проходивших плановое лечение в стационаре. Материал собирали в пробирки типа Vacutainer с активатором свертывания крови. Пробы были подвергнуты центрифугированию при 1200g 10 мин согласно ГОСТ Р53079.4—2008 [10].

Все образцы для достижения цели исследования были разделены на две группы: 1-я группа — образцы сыворотки аликвотировали и исследовали согласно протоколу; 2-я — образцы сыворотки исследовали без аликвотирования (клеточный компонент не отделялся).

Пробы исследовали на автоматическом биохимическом анализаторе Abbott Architect c8000 реактивами производителя оборудования. Данные, полученные при первом исследовании, были приняты за нулевую точку. Затем образцы обеих групп были помещены в соответствующие температурные условия (4, 23 и 30 °С). По прохождению 4, 24, 48, 72 ч для 1-й группы и 4, 8, 24, 48 ч для 2-й группы проводили измерение следующих аналитов в пробах: АЛТ, АСТ, билирубин общий, глюкоза, калий, креатинин, КФК, ЛДГ, мочевина, натрий, общий белок, триглицериды, фосфатаза щелочная, хлор, холестерин.

Статистическую обработку результатов исследования проводили при помощи пакета программ статистической обработки «Statistica 10.0» и программы «Microsoft Office Excel». Все показатели обследуемых проверяли на соответствие нормальному распределению с применением критерия Шапиро—Уилка. Для определения статистической значимости различий между двумя связанными группами использовали критерий Вилкоксона для непараметрических выборок. Пороговое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

Результаты

Сравнительная оценка клинической значимости изменений уровня аналитов выполнена на основании сравнения величин критической разницы (Reference Change Value — RCV). RCV рассчитывали по следующей формуле:

где CVa — долгосрочный коэффициент вариации аналитов (260 точек), полученный из данных внутрилабораторного контроля, а CVi — коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации для исследуемого аналита [11]. Z — уровень доверительной вероятности для 95% равен 1,96 (80% — 1,28). Данные, по которым вычисляли RCV, представлены в табл. 1.

Таблица 1. RCV для исследуемых аналитов Примечание. * — http://www.westgard.com/biodatabase1.htm

После получения результатов для оценки изменения уровня аналитов провели анализ с использованием формулы для определения статистической погрешности в показаниях средства измерения:

где В — смещение, xi — значение концентрации аналита каждого пациента, ЦЗ — целевое значение. В данном случае за ЦЗ принимали значение показателя каждого пациента на нулевой точке измерения.

Результаты статистической обработки для 1-й и 2-й групп приведены в табл. 2, 3.

Таблица 3. Показатели среднего смещения (B, %) аналитов во 2-й группе Примечание. * — статистически значимый результат (p<0,05); ** — клинически значимый результат (B>RCV 80%); *** — клинически значимый результат (B>RCV 95%).
Таблица 2. Показатели среднего смещения (B, %) аналитов в 1-й группе Примечание. * — статистически значимый результат (p<0,05).

Показатели смещения (B, %) аналитов в 1-й группе, представленные в табл. 2, описывают результаты хранения проб сыворотки крови без клеточного компонента. В течение 72 ч, в том числе при 30 °C, не происходит клинически значимых изменений уровня аналитов на всем протяжении наблюдения. Статистически значимые изменения уровней АСТ, общего билирубина, глюкозы, щелочной фосфатазы происходили уже после 4 ч хранения образцов.

Показатели смещения (B, %) аналитов во 2-й группе, представленные в табл. 3, описывают результаты хранения проб сыворотки c клеточным компонентом крови. Из табл. 3 видно, что результаты во многом схожи с таковыми 1-й группы. Статистически значимые изменения концентраций выявляются уже после 4 ч хранения по следующим аналитам: общий билирубин, глюкоза. Согласно данным табл. 1 клинически значимые изменения концентраций произошли по калию и глюкозе. Уровень глюкозы клинически значимо изменялся в результате хранения 48 ч при 4 °C (24 ч при RCV 80%); 48 ч при 23 °C; 24 и 48 ч при 30 °C (рис. 1).

Рис. 1. Динамика уровня глюкозы в зависимости от температуры и времени хранения образца, 2-я группа.
Уровень калия клинически значимо изменился в результате хранения 24 и 48 ч при температуре 4 °C; 48 ч при 23 и 30 °C (рис. 2).
Рис. 2. Динамика уровня калия в зависимости от температуры и времени хранения образца, 2-я группа.

Обсуждение

В ходе эксперимента 1981 г. были выявлены клинически значимые изменения по следующим аналитам: натрий при 30 °C и длительности хранения 48 ч; калий после 48 ч при 4°, 23° и 30°; глюкоза при хранении 48 ч при 4, 23 и 30 °C. Для натрия клинически значимым авторы считали смещение в 3%, что несколько меньше критерия, выбранного по условиям нашего исследования — 4,3% (см. табл. 1). В остальном полученные данные оказались сопоставимы.

Несмотря на статистически значимые изменения в исследуемых группах образцов крови (см. табл. 2, 3), клинически значимые изменения были выявлены только в редких случаях. Отсутствие клинически значимых изменений уровня аналитов в 1-й группе (см. табл. 2) объясняется менее выраженным влиянием клеточного компонента на сыворотку крови. Во 2-й группе (см. табл. 3) клинически значимые изменения были выявлены по уровню калия и глюкозы. Изменение уровня калия происходит в результате ингибирования натрий-калиевого насоса и повышения проницаемости мембран эритроцитов, что приводит к выходу ионов калия по градиенту концентрации, более активно эти процессы протекают при низкой температуре (см. рис. 1). Изменения уровня глюкозы наблюдаются по причине использования ее клеточной массой в качестве источника энергии.

На примере глюкозы во 2-й группе образцов мы получили различные сроки приемлемого хранения образца в зависимости от степени достоверности клинически значимого смещения (RCV 95 и 80%). Необходимо отметить, что в ряде случаев 80% степени достоверности достаточно для регистрации неблагоприятной тенденции, в литературе такие результаты отмечаются терминами «указывающий» и «обращающий внимание на» [12].

Часто в рекомендациях по хранению и транспортировке образцов крови можно встретить фразу о том, что сыворотку/плазму необходимо отделить от клеточных элементов не позднее 2 ч после венепункции [13]. Однако указанные утверждения касаются далеко не всех аналитов, что подтверждают результаты настоящего исследования, в то же время соблюдение такого временного интервала часто бывает трудно достижимо.

Вывод

При сохранении форменных элементов в образцах (2-я группа) происходит клинически значимое изменение следующих аналитов:

— уровень калия начинает увеличиваться при температуре хранения 4 °C через 24 ч, при температурах хранения 23 и 30 °C через 48 ч;

— уровень глюкозы начинает уменьшаться при температуре хранения 4 °C через 48 ч, при температурах хранения 23 и 30 °C через 24 ч.

Результаты нашего исследования, безусловно, представляют большой практический интерес, поскольку не только подтверждают данные других исследований, объективно указывая на важность соблюдения температурного режима и времени хранения образцов крови для лабораторного исследования, но и позволяют убедиться в достаточной стабильности значительного количества рутинных аналитов при надлежащем обеспечении преаналитического этапа лабораторных исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: dmi6141@gmail.com;ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9752-2539

Список литературы:

  1. Lippi G, Bassi A, Bovo C. The future of laboratory medicine in the era of precision medicine. Journal of Laboratory and Precision Medicine. 2016;1:7-7. https://doi.org/10.21037/jlpm.2016.12.01
  2. Lippi G, Bowen R, Adcock D. Re-engineering laboratory diagnostics for preventing preanalytical errors. Clinical Biochemistry. 2016;49(18):1313-1314. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2016.10.010
  3. Cornes M, Church S, van Dongen-Lases E, Grankvist K, Guimarães J, Ibarz M, Kovalevskaya S, Kristensen G, Lippi G, Nybo M, Sprongl L, Sumarac Z, Simundic A. The role of European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine Working Group for Preanalytical Phase in standardization and harmonization of the preanalytical phase in Europe. Annals of Clinical Biochemistry. 2016;53(5):539-547. https://doi.org/10.1177/0004563216643969
  4. Plebani M, Favaloro E, Lippi G. The Changing Face of Hemostasis Testing in Modern Laboratories: Consolidation, Automation, and Beyond. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2015;41(3):294-299. https://doi.org/10.1055/s-0035-1544196
  5. Lippi G, Mattiuzzi C. Biological samples transportation by drones: ready for prime time? Annals of Translational Medicine. 2016;4(5):92-92. https://doi.org/10.21037/atm.2016.02.03
  6. Ono T, Kitaguchi K, Takehara M, Shiiba M, Hayami K. Serum-constituents analyses: effect of duration and temperature of storage of clotted blood. Clin Chem. 1981;27(1):35-38.
  7. Мошкин А.В., Долгов В.В. Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике. Практическое руководство. М.: Медиздат, 2004.
  8. Гудер В.Г., Нарайанан С., Виссер Г., Цавта Б. Пробы: от пациента до лаборатории. Влияние факторов преаналитического этапа на качество результатов лабораторных исследований. М.: Лабора, 2010.
  9. Lippi G, Cervellin G, Favaloro EJ, Plebani M. In Vitro and In Vivo Hemolysis. Berlin/Boston: De Gruyter; 2012:63-79. https://doi.org/10.1515/9783110246148
  10. ГОСТ Р 53079.4-2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа. http://docs.cntd.ru/document/1200072566
  11. Fraser CG. Reference change values. Fraser, C. (2012). Reference change values. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2011;50(5):807-812. https://doi.org/10.1515/cclm.2011.733
  12. Fraser G Callum. Biological variations: from principles to practice. Washington: AACC Press; 2001.
  13. Clinical Laboratory Standards Institute. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens for Common Laboratory Tests; Approved Guideline — Fourth Edition. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010. CLSI document H18-A4. https://clsi.org/standards/products/general-laboratory/documents/gp44/