Список сокращений

АТ — антитела

БАЛ — бронхоальвеолярный лаваж

ВКО — внутренний контрольный образец

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК — комплементарная ДНК

К– — отрицательный контроль

К+ — положительный контроль

МАНК — методы амплификации нуклеиновых кислот

МР — методические рекомендации

МУ — методические указания

НК — нуклеиновая кислота

ОКО — отрицательный контрольный образец

ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция

ОРЗ — острое респираторное заболевание

ОТ — обратная транскрипция

ПК — положительный контроль

ПКО — положительный контрольный образец

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-КТ — ПЦР с детекцией в формате «по конечной точке»

ПЦР-РВ — ПЦР с детекцией в формате «реального времени»

РНК — рибонуклеиновая кислота

СанПиН — санитарные правила и нормы

ТОРС — тяжелый острый респираторный синдром

УФ — ультрафиолетовое излучение

FEP — Fluorescence End Point (детекция флуоресценции в формате «по конечной точке»)

FRT — Fluorescence Real Time (детекция флуоресценции в формате «реального времени»)

hAdv — Human Adenovirus

hBov — Human Bocavirus

hCov — Human Coronavirus

hPiv — Human Parainfluenza virus

hRSv — Human Respiratory Syncytial virus

hRv — Human Rhinovirus

MERS — Middle East Respiratory Syndrome

MMlv — название фермента для обратной транскрипции

Mpv — Metapneumovirus

RT — Reverse Transcrption

SARS — Severe Acute Respiratory Syndrome

Доказательной базой для рекомендаций явились публикации, вошедшие в базы данных Cochrane library, PubMed, EMBASE и MEDLINE, электронную библиотеку (www.e-library.ru). Глубина поиска составила 16 лет.

Клинические рекомендации созданы на основе согласованного мнения членов ассоциации специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины», а также обобщения опыта авторов, специалистов обществ пульмонологов России (Российское Респираторное Общество) и стран Европы (Европейское Респираторное Общество) и апробированных рекомендаций, действующих в настоящее время в Великобритании (Harris M., Lim W.S.) США (Bartlett J.G., Mandell L.A.), Швеции (Regamey N.).

Оценка уровня доказательности и значимости рекомендаций производилась в соответствии с данными, изложенными ниже.

Уровни доказательности рекомендаций приводятся при изложении текста ниже.

В методических рекомендациях представлены современные сведения о возбудителях ОРВИ, включая эпидемиологические данные о новых видах вирусов, описанных в последнее десятилетие. Представлен общий методический подход и подробный порядок проведения лабораторного исследования методом ПЦР с целью обнаружения НК гриппа и других значимых возбудителей ОРВИ. Особое внимание уделено описанию перечня биологического материала и правил его получения, упаковки, транспортирования и хранения биологического материала от больных (умерших).

Клинические рекомендации предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих работы c использованием методов амплификации НК при исследовании материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I—IV групп патогенности (опасности), аккредитованных в установленном порядке и имеющих лицензии на данный вид деятельности в соответствии с законодательством Российской Федерации.

1. СП 1.3.2322−08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

2. СП 1.3.3118−13 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)».

3. СП 1.2.036−95 «Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I—IV групп патогенности».

4. СанПиН 2.1.7.2790−10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

5. Национальный Стандарт Российской Федерации. Лаборатории медицинские. Требования безопасности. ГОСТ Р 52905−2007 (ИСО 15190:2003)

6. Национальный Стандарт Российской Федерации. Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности. ГОСТ Р (ИСО 15189−2009)

7. СП 3.1.12.3117−13 «Профилактика гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций».

8. МУ 1.3.2569−09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенности».

9. МУ 3.1.2.3047−13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями».

10. МУК 4.2.3115−13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний».

11. МУ 1.3.1877−04 «Порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторного анализа биологического материала от больных (и умерших) пациентов с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)».

12. МУ 4.2.2.136−06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа, А (ВГПА), у людей».

13. МУ 3.4.3008−12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней».

14. Приказ 19 апреля 1995 г. № 101/46 «О защите населения от гриппа и других острых респираторных заболеваний» (в ред. Приказа Минздрава Р.Ф. от 27.01.1998 № 25) с Приложением № 4 к Методическим указаниям по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ.

15. МР «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация». Утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 18 апреля 2006 г. № 0100/4430−06−34.

Заболеваемость острыми инфекциями верхних дыхательных путей (ОРВИ) множественной или неуточненной локализации и гриппом в России по данным официальной статистики (форма 1) в совокупности составляет 19—20 тыс. на 100 тыс. населения ежегодно, превышая в десятки раз аналогичные показатели для других инфекционных болезней, и составляет 90% всех регистрируемых случаев инфекционных и паразитарных болезней. Дети дошкольного возраста подвержены острым респираторным заболеваниям (ОРЗ), в среднем, 4—8 раз в год, школьники от 2 до 6 раз в год, взрослые 2—3 раза в год. В контингентах часто болеющих детей эпизоды ОРЗ регистрируются от 10 до 12 раз в год.

В 90% случаев ОРЗ вызывают возбудители ОРВИ, причиной которых могут являться представители 5 семейств вирусов, геном которых представлен молекулой РНК (ортомиксовирусы, пневмовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и пикорнавирусы) и 2 семейств вирусов, геном которых представлен молекулой ДНК (аденовирусы, парвовирусы). Ведущее место среди острых инфекций дыхательных путей занимает грипп, возбудитель которого периодически вызывает пандемии, последняя из которых наблюдалась в 2009—2010 гг. Эпидемии гриппа охватывают от 5 до 20% населения, приводят к госпитализации порядка 3 млн человек и вызывают до 250—500 тыс. летальных исходов в мире ежегодно (CDC. MMWR, 2010). У взрослых больных гриппом в 10—15% случаев развиваются осложнения, причем 80% из них приходится на пневмонию. При развитии пневмонии у детей вирусы гриппа обнаруживают в 7—22% случаев. Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода — Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С, каждый из которых имеет по одному виду — Influenza A virus, Influenza В virus и Influenza С virus.

Вирусы гриппа, А (Influenzavirus A), широко распространены в природе, их выделяют от большинства зверей и птиц, и по этой причине, они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовые барьеры. Способность вирусов гриппа, А к быстрому накоплению мутаций, изменяющих их антигенные свойства, лежит в основе их высокого эпидемического потенциала. Вирусы гриппа, А в настоящее время дифференцируют (типируют) с помощью генетических методов на подтипы (или субтипы) в соответствии с генетической структурой генов гемагглютинина (HА) на 16 субтипов и нейраминидазы (NА) на 9 субтипов. В 2013 г. при скрининге у летучих мышей в Центральной Америке и Перу были обнаружены новые субтипы вирусов гриппа, обозначенные как H17N10 и H18N11. Значительную обеспокоенность вызывает циркуляция в природе патогенных для человека вирусов гриппа птиц. Регистрируются крупные эпизоотии, вызванные вирусами гриппа субтипов H7 и H9, сопровождаемые заболеванием людей (Гонконг — H9N2, 1998—1999 гг., Нидерланды-H7N7, 2003 г.), в ряде случаев с летальным исходом. С 2005 г. эпизоотии гриппа H5N1, повлекли за собой заболевания людей в десятке стран мира с летальностью 60%. В июне 2013 г. ВОЗ сообщила о 132 лабораторно подтвержденных случаях инфекции, вызванной вирусом гриппа A/H7N9, включая 37 случаев, закончившихся летально. Таким образом, на настоящее время актуален мониторинг вирусов гриппа, имеющих в геноме сегмент, кодирующий НА субтипов H5, H7 и H9.

Вирусы гриппа В выделяют только от людей. Наряду с гриппом А, они занимают значительную долю в структуре летальности при гриппе у детей. Так, в США в сезоне 2010—2011 гг. вирус гриппа В стал причиной 38% случаев летального исхода от гриппа у детей, заняв в структуре циркулирующих вирусов гриппа 26% (CDC. MMWR., 2011).

У людей вирусы гриппа С вызывают спорадические ОРЗ. Среди животных вирусы гриппа С выделяют от свиней, при экспериментальном заражении заболеванию подвержены собаки. Вирусы гриппа А, В и С дифференцируют друг от друга с помощью иммунологических и МАНК.

Помимо гриппа, причиной ОРЗ являются: пневмовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (Human Respiratory syncytial virus) и метапневмовирус человека (Human Metapneumovirus), парамиксовирусы — 4 вида (1—4) вирусов парагриппа (Human Parainfluenza virus 14), коронавирусы (Human Coronavirus 229E, Human Coronavirus OC43, Human Coronavirus NL63, Human Coronavirus HKUI), риновирусы (Rhinovirus) виды А, В, С, относящиеся к пикорнавирусам, аденовирусы (Human mastadenovirus) виды B, C, E, бокавирус человека (Human bocavirus), относящийся к парвовирусам. Все вышеперечисленные вирусы вызывают ОРЗ среди всех возрастных групп, за исключением бокавируса человека, инфицирующего только детей. У лиц со сниженной активностью иммунной системы, причиной ОРЗ могут быть также энтеровирусы, вирусы герпеса, цитомегаловирус. Дифференциальная диагностика гриппа и других ОРВИ возможна только с помощью лабораторных методов исследования.

Респираторно-синцитиальный вирус (hRSv, РС-вирус) является основным возбудителем бронхиолитов и пневмоний у младенцев и детей младшего возраста во всем мире (Nair H., Stockman L.J.). Частота hRSv у больных внебольничной пневмонии детей колеблется от 15,7 до 31,8% в зависимости от региона эпидемического сезона и возраста и максимальна у госпитализированных детей первого года жизни (Rohde G.G.U., Harris M.). В группу риска тяжелого течения PC-инфекции входят недоношенные младенцы, дети до 2 лет, дети и взрослые с ослабленной вследствие заболеваний или лечения иммунной системой, пожилые люди (старше 65 лет). В годы эпидемической активности hRSv составляет 44% в этиологической структуре острых бронхитов у госпитализированных детей (Яцышина С.Б., 2008).

Клинико-эпидемиологические исследования инфекции, вызванной метапневмовирусом (hMPv), впервые обнаруженным в 2001 г., демонстрируют сходство клинической картины с RSv-инфекцией. Исследования специфических антител к вирусу в разных популяциях свидетельствуют о широкой распространенности hMPv, практически все дети имеют такие АТ к 5 годам жизни. MPv-инфекция составляет от 5 до 25% случаев госпитализаций с острой инфекцией нижних дыхательных путей детей младшего возраста (Edwards K.M.). Основными диагнозами hMPv-инфекции у детей являются бронхиолиты, пневмония и бронхиальная астма. У детей при пневмонии метапневмовирус обнаруживают в 8—14,5% случаев (Williams J.V., 2010; Rohde G.G.U.). hMPv, как и hRSv, могут служить причиной групповых заболеваний в домах малютки и домах престарелых, вызывая заболевания нижних дыхательных путей (до 79%) и приводя к летальным исходам (до 11%) (CDC. MMWR. 2013).

Вирусы парагриппа (hPiv) разделяют на 4 вида, относящиеся к двум родам: респировирусы (парагрипп 1 и 3) и рубулавирусы (парагрипп 2 и 4). Вирусы парагриппа часто обнаруживаются у детей младшего возраста. Ко второму году жизни каждый ребенок хотя бы один раз переболевает ОРЗ, вызванным вирусами парагриппа. hPiv 2 и 4 чаще обнаруживают у детей первого года жизни по сравнению с другими возрастными группами, где превалируют вирусы парагриппа 1 и 3. Среднегодовая частота обнаружения РНК hPiv у больных ОРЗ составляет около 5% (Яцышина С.Б., 2008, 2013, 2015). При этом в этиологической структуре тяжелых крупов у детей первых лет жизни вирусы парагриппа занимают до 40% (Fields B., 2001). Среди детей с заболеваниями нижних дыхательных путей, госпитализированных в стационары, инфицированные hPiv, составляют около 22% (Weinberg G.A.). Все это ставит вирусы парагриппа на второе место среди возбудителей ОРВИ по частоте госпитализации и тяжести заболевания после респираторно-синцитиального вируса.

Среди аденовирусов (hAdv) выделяют 7 видов: A, B, C, D, E, F, G. В зависимости от вида, аденовирусы вызывают различные инфекционные заболевания: конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты (A, D), острые диарейные заболевания (F), гастроэнтериты (G), крупы, гриппоподобные заболевания, бронхиты и пневмонии — B, C, E. Известны случаи бессимптомного носительства hAdv в лимфоидной ткани верхних дыхательных путей на протяжении нескольких месяцев и лет, которые могут быть источником возбудителя. Будучи относительно устойчивыми к химическим и физическим воздействиям, hAdv могут длительное время сохранять стабильность в окружающей среде, и по этой причине, часто вызывают вспышки в детских дошкольных учреждения, домах ребенка, домах престарелых, и прежде всего, в воинских частях, где частота выявления hAdv достоверно превышает таковую у взрослых штатских и детей (Львов Н.И.). При этом заболевание может протекать со случаями пневмонии тяжелого течения, и даже заканчиваться летальным исходом (Яцышина С.Б., 2014).

Коронавирусы (hCov) представляют собой большую разнообразную группу вирусов, которая классифицируется как альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирусы. Различные виды коронавирусов широко распространены в природе, вызывая различную инфекционную патологию у животных: гастроэнтериты и респираторные инфекции у свиней, инфекционный бронхит у кур, энтериты у собак, инфекционный перитонит у кошек. Как показали исследования последних двух лет, летучие мыши инфицированы разнообразными альфа- и бета-коронавирусами. У человека острую респираторную инфекцию вызывают 4 вида коронавирусов: 229E, OC43, NL63, HKUI, чаще протекающую с поражением верхних дыхательных путей легкой или средней тяжести (Bradburne AF), и в редких случаях — с инфекциями нижних дыхательных путей (Woo PC). Коронавирусы обнаруживаются преимущественно у детей младшего возраста с симптоматикой крупа и ларингита (van der Hoek L.). У детей старшего возраста и у взрослых при коронавирусной инфекции может отмечаться гриппоподобная симптоматика, а также кашель и ринорея.

В настоящее время семейство коронавирусов включает 2 вида вирусов, вызывающих тяжелую респираторную инфекцию у людей: SARS-Cov (Severe acute respiratory syndrome coronavirus, или ТОРС-коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром) и MERS-Cov (Middle East respiratory syndrome coronavirus, или БВРС-коронавирус, вызывающий Ближневосточный респираторный синдром). Коронавирус ТОРС вызвал эпидемию в 2003 г. в 33 странах мира (наибольшее количество заболевших было зарегистрировано в Китае, Сингапуре и Канаде), с общим числом заболевших 7761 человек, у 623 из них заболевание закончилось летальным исходом (Memish Z.A.). Вирус SARS-Cov легко передается от человека к человеку. С сентября 2012 г. на Ближнем Востоке регистрируются случаи новой инфекции, вызванные коронавирусом MERS-Cov, летальность по данным ВОЗ составляет порядка 43%. Предполагают, что инфицирование людей происходит при контакте с верблюдами или с контаминированными вирусом объектами окружающей среды в домашнем хозяйстве или при посещении животноводческих ферм. Подтверждена возможность передачи MERS-Cov от человека к человеку при близком и длительном контакте, что может провоцировать вспышки внутрибольничной инфекции в человеческой популяции (Assiri A.D.). Природным резервуаром обоих вирусов являются летучие мыши.

Самым распространенным возбудителем ОРВИ среди взрослого населения и детей всех возрастных групп являются риновирусы (hRv), вызывающие воспаление слизистой оболочки верхних дыхательных путей с ринореей и кашлем; в качестве осложнения нередко развивается трахеит. Риновирусы, в отличие от других респираторных вирусов, часто обнаруживаются у детей без явно выраженных симптомов острой респираторной инфекции, по разным данным — от 15% (Jansen R.R., 2011) до 27% (Яцышина С.Б., 2016) обследованных. Такую ситуацию можно объяснить длительной (2 нед и более) персистенцией риновирусов в слизистой носоглотки после острой инфекции (Olofsson S., 2011), либо инаппарантной инфекцией, либо обследованием детей, находящихся в инкубационном периоде после инфицирования. Гораздо реже у детей без симптомов ОРЗ в мазках из носо- и ротоглотки выявляются НК коронавирусов (не более 2,6%), вирусов парагриппа (не более 2,4%), респираторно-синцитиального вируса (не более 2,2%), бокавируса (не более 1,2%), вирусов гриппа, аденовирусов и метапневмовируса (менее 1%) (Яцышина С.Б., 2016). Тем не менее, принимая во внимание тот факт, что риновирусы обнаруживают у детей при пневмонии (Kieninger E; Яцышина С.Б., 2016), и экспериментально доказана возможность репликации риновирусов в ткани легких млекопитающих (Schroth M.K.), нельзя недооценивать данный возбудитель как причину поражения нижних дыхательных путей у детей. Среди Rv в настоящее время выделяют 3 вида вирусов: А, В, C и более 100 серотипов, которые предположительно, обладают разной патогенностью.

Бокавирус (hBov), впервые описанный в 2005 г., обнаруживается со среднегодовой частотой 1,5—19% как единственный возбудитель острой инфекции дыхательных путей у детей до 5 лет (Кондратьева Т.Ю.), вызывая лихорадку, кашель, риниты и диарею (Вартанян Р.В.). Помимо этого, бокавирус часто обнаруживается в сочетании с другими возбудителями ОРЗ. При пневмонии у детей бокавирусы обнаруживаются в 4—15% случаев (Honkinen M.; Esposito S.; Яцышина С.Б., 2016). У взрослых, находящихся в тесном контакте с больными детьми, бокавирус может вызывать легкие симптомы ОРЗ (Кондратьева Т.Ю.), в редких случаях вирус обнаруживается при пневмонии на фоне иммунодефицита.

Наиболее тяжело протекают острые инфекции дыхательных путей, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом, метапневмовирусом, вирусами парагриппа и коронавирусами, у детей в возрасте до 5 лет, пожилых и у лиц с иммунодефицитом.

Современные данные свидетельствуют, что случаи инфекций нижних дыхательных путей вирусной этиологии не следует рассматривать как единичные или очень редкие. Вирусные возбудители инфекций дыхательных путей обнаруживаются у 10% пациентов ВП, нуждающихся в интенсивной терапии (Harris M.).

Внедрение в клиниках методов ранней этиологической лабораторной диагностики вирусных инфекций позволит клиницистам своевременно применять средства специфической противовирусной терапии, разрабатывать эффективную тактику ведения пациентов с инфекцией определенной этиологии, и тем самым, предотвращать осложнения и летальные исходы.

Инфекционные болезни

— Острые респираторные инфекции верхних дыхательных путей

— Острые респираторные инфекции нижних дыхательных путей

Пульмонология

— Пневмония

— Плевральный выпот

Пульмонология + Инфекционные болезни

— Грипп с пневмонией

Терапия +Пульмонология

— Инфекция нижних дыхательных путей

— J00 Острый назофарингит (насморк)

— J01 Острый синусит

— J02 Острый фарингит

• J02.8 Острый фарингит, вызванный другими уточненными возбудителями

• J02.9 Острый фарингит неуточненный

— J03 Острый тонзиллит

• J03.8 Острый тонзиллит, вызванный другими уточненными возбудителями

• J03.9 Острый тонзиллит неуточненный

— J04 Острый ларингит и трахеит

• J04.0 Острый ларингит

• J04.1 Острый трахеит

• J04.2 Острый ларинготрахеит

— J05 Острый обструктивный ларингит (круп) и эпиглоттит

• J05.0 Острый обструктивный ларингит (круп)

— J06 Острые инфекции верхних дыхательных путей множественной и неуточненной локализации

• J06.0 Острый ларингофарингит

• J06.8 Другие острые инфекции верхних дыхательных путей множественной локализации

• J06.9 Острая инфекция верхних дыхательных путей неуточненная

— J10—J18 Грипп и пневмония

— J20—J22 Другие острые респираторные инфекции нижних дыхательных путей

• J20 Острый бронхит

• J21 Острый бронхиолит

• J22 Острая респираторная инфекция нижних дыхательных путей неуточненная

— J40 Бронхит, не уточненный как острый или хронический

— J90 Плевральный выпот, не классифицированный в других рубриках.

Исследование имеют право проводить специалисты с высшим образованием — врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи, прошедшие первичную специализацию по клинической лабораторной диагностике и периодическое повышение квалификации в установленном порядке. Врачи и биологи должны иметь удостоверение о краткосрочном повышении квалификации «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» на лицензированных курсах. Требования к знаниям и умениям специалистов должны соответствовать образовательным стандартам и другим нормативным документам, действующим на территории Р.Ф. Врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи осуществляют контроль всего технологического процесса и непосредственно выполняют этапы молекулярно-биологического исследования по выявлению НК вирусов — возбудителей гриппа и ОРВИ, требующие высокой квалификации и специальной подготовки, принимают решение о необходимости дополнительных исследований (повторное проведение исследования и т. п.). Врачи клинической лабораторной диагностики консультируют врачей-инфекционистов и помогают в интерпретации результатов исследований.

Врачи клинической лабораторной диагностики (врачи-бактериологи, биологи) должны знать:

— все этапы подготовительной работы и проведения молекулярно-биологического исследования: правила взятия биологического материала, правила техники безопасности при работе с потенциально инфицированным биологическим материалом, требования к доставке и хранению материала, методики проведения исследования, критерии оценки результатов исследования.

Должны уметь:

— провести молекулярно-биологическое исследование, обработать результаты.

Подготовительную работу (прием поступающих в лабораторию образцов и сопроводительных документов, регистрацию полученного биологического материала, проведение технических манипуляций, не требующих высокой квалификации: подготовка помещений, ламинарных боксов, расходных материалов, утилизация использованных расходных материалов и остатков использованных биологических образцов) выполняет специалист со средним медицинским образованием и соответствующей квалификацией (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант), имеющий сертификат специалиста и прошедший периодическое повышение квалификации в установленном порядке.

ПЦР-исследование выполняется в организациях, имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданное в установленном порядке.

Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы с помощью МАНК, связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к медицинской организации при проведении данных работ с целью предотвращения контаминации НК и/или ампликонами исследуемых проб, помещений, оборудования. Лица, отвечающие за сбор, доставку и анализ образцов биологического материала, должны руководствоваться правилами и техникой безопасности при работе с ними. Все образцы биологического материала считают потенциально опасными, т.к. они могут содержать патогенные микроорганизмы.

Противоэпидемический режим в лаборатории, выполняющей ПЦР-исследование, должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.2322−08, регламентирующими работу с микроорганизмами III—IV групп патогенности.

Персонал, непосредственно участвующий в проведении ПЦР-исследований, обязан соблюдать общие правила работы в молекулярно-биологических лабораториях (МУ 1.3.2569−09, СП.1.3.2322−08), строго придерживаться общих стандартов по формированию и поддержанию безопасности рабочей среды в медицинских лабораториях при манипуляциях с пробами пациентов, химическими реактивами и другими объектами потенциальной опасности для здоровья людей (ГОСТ Р 52905−2007).

Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам, используемым в технологии (амплификаторы, центрифуги, термостаты и др.); персонал, работающий с реактивами, должен быть обучен обращению с ними, использовать средства персональной защиты, соблюдать правила личной гигиены.

Для предупреждения пожаров необходимо соблюдать правила пожарной безопасности в соответствии с действующими нормативными документами.

Сбор, временное хранение, обеззараживание и транспортировка потенциально опасных отходов, загрязненных остатками биологического материала, образующихся в процессе выполнения технологии, должна проводиться в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами (СанПиН 2.1.7.2790−10). Отходы, содержащие (потенциально содержащие) микроорганизмы (материалы и инструменты, предметы загрязненные кровью и/или другими биологическими жидкостями) относятся к отходам класса Б, подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции)/обезвреживанию. Выбор метода обеззараживания/обезвреживания определяется возможностями организации, осуществляющей медицинскую деятельность. Отходы класса Б собираются в одноразовую мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) желтого цвета или имеющие желтую маркировку. Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов. Реагенты, используемые для проведения экстракции нуклеиновых кислот и ПЦР, относятся к отходам класса Г. Отходы класса Г собираются в мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) любого цвета, кроме красного и желтого. Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов. Вывоз и обезвреживание отходов класса Г должно производиться аккредитованной организацией.

Необходимо предусмотреть для обеззараживания исследуемого материала наличие автоклавной комнаты, которая может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности. Сбор, хранение и утилизация отходов проводится в соответствии с требованиями СП 2.1.7.2790−10 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

Организация помещений, требования к оборудованию и правила работы в лаборатории, выполняющей исследование с помощью МАНК, должны соответствовать методическим указаниям МУ 1.3.2569−09. Согласно методическим указаниям, лаборатория, в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений: 1) зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала; 2) зону выделения нуклеиновых кислот; 3) зону проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационно-флюоресцентного метода детекции.

Работа лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, должна быть организована согласно СП 1.3.1285−03 и (или) СП 1.3.2322−08, МУ 1.3. 2569 -09. В лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III—IV группы патогенности, допускается исследование биологического материала, подозрительного на инфицирование микроорганизмами II группы патогенности только в тех случаях, для которых разработаны и утверждены нормативные документы, регламентирующие порядок проведения таких исследований в условиях данной лаборатории.

Для выполнения исследований используют стандартные оборудование, диагностические наборы реагентов, реагенты и расходные материалы, имеющие соответствующие сертификаты качества и действующий срок годности, разрешенные к применению на территории РФ в установленном порядке.

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми МАНК согласно приложению 1.

Для проведения диагностики гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции, лаборатории должны быть оснащены материально-техническими ресурсами согласно приложению 2.

Важным моментом исследования является правильный выбор, отбор, хранение и использование биологического материала. Биологический материал должен соответствовать конкретной нозологии заболевания, содержать максимальное количество возбудителя (генома возбудителя) и быть доступным для получения неинвазивными методами. Для диагностики ОРВИ преимущественно используется биологический материал из дыхательных путей, соответствующий локализации поражения: при заболеваниях верхних дыхательных путей используются мазки из носоглотки и ротоглотки; в случае заболевания нижних дыхательных путей — материал из трахеи, бронхов и легких. При наличии выпота в плевральной полости также исследуется плевральная жидкость; при наличии менингеальной симптоматики — спинномозговая жидкость. Для диагностики отдельных инфекций могут использоваться дополнительные виды биологического материала, что указывается в инструкции к диагностическому набору. Например, для диагностики тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом ТОРС, помимо материала из респираторного тракта используются фекалии и плазма крови. При проведении исследования с целью определения этиологии ОРЗ с летальным исходом, исследуется секционный материал пораженных органов.

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции верхних дыхательных путей исследуются мазки со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки (AI). Максимальная концентрация вирусов в этих отделах достигается на 2-й, 3-й день от момента появления симптомов заболевания (AI). В связи с этим, брать материал для исследования предпочтительно именно в эти указанные сроки. В то же время, метод ПЦР позволяет обнаружить НК возбудителя и гораздо позднее — в среднем до 7 дней и максимум — до 2 нед от начала заболевания (при условии сохранения признаков поражения верхних дыхательных путей) (AII). Тем не менее, у госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами (AII).

Мазки со слизистых оболочек верхних дыхательных путей у пациента берут двумя разными зондами: сначала со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки и объединяют вместе с целью повышения чувствительности исследования (AII): концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну пробирку объемом 1,5—2 мл с 0,5 мл транспортной среды.

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей исследуется материал из нижних дыхательных путей (AI): мокрота (при глубоком откашливании), плевральная жидкость, эндотрахеальные аспираты из трахеи, получаемые с помощью хирургического (вакуумного или электрического) отсоса, бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) или промывные воды бронхов, получаемые с помощью фибробронхоскопии, мокрота (откашливаемая свободно или откашливаемая после индукции ингаляцией стерильного 5% раствора натрия хлорида через небулайзер или полученная аспирацией из трахеи).

В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей, при исследовании для выявления респираторных вирусов допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (мазки со слизистой носоглотки из нижнего носового хода и мазки со слизистой задней стенки ротоглотки) (BII).

В случае летального исхода с целью определения этиологии инфекции исследуется посмертный (аутопсийный) материал (AI).

Расходные материалы и оборудование для сбора биологического материала представлены в приложении 3.

4.2.1. Особенности сбора проб у разных категорий пациентов

Мазки со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение 6 ч перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту.

У детей мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (AI) (3—4 см для детей). После сбора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой до места слома, при этом гибкая часть зонда складывается в три раза, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

У взрослых мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе (допустимо использовать сухой стерильный зонд из полистирола с вискозным тампоном). Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2—3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (AI) (не менее 5 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают на глубину 1 см в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой, конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки, опустив рукоятку зонда вниз. Пробирку герметично закрывают.

Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампон