Согласно данным базы COSMIC в онко-ассоциированной последовательности 12-го экзона гена JAK2 описано более 40 соматических мутаций, важных для подтверждения диагноза истинной полицитемии (ИП). Ранее нами был предложен метод количественного анализа нагрузки мутантного аллеля методом пиросеквенирования (Subbotina, 2015). Вместе с тем, пиросиквенс для всех пациентов имеющих подозрение на ИП и отсутствием стандартной мутации V617F в 14-м экзоне гена JAK2 требует серьезных финансовых затрат. В связи с этим актуально предварительное проведение менее дорогостоящего скринингового теста, позволяющего отсеять пробы с минимальной вероятностью искомой мутации. Цель исследования — использование метода вертикального электрофореза в ПААГ для качественной оценки наличия мутаций в 12-м экзоне гена JAK2. Материал и методы. Использованы образцы ДНК двух пациентов с ИП и ранее выявленными методом количественного пиросиквенса мутациями в 12-м экзоне гена JAK2: N542-E543del и I540-E543delinsKK. Образцы амплифицировали методом ПЦР-РВ в присутствии EVA Green («СИНТОЛ», Москва). ПЦР с этапом плавления проводилась на приборе CFX96, в соответствии с регламентом (Amy V. Jones, 2008). В реакционную пробу вносили 30 нг ДНК, размер ампликонов дикого типа — 126bp. С продуктами амплификации проводили электрофорез в 8% ПААГ с использованием маркера веса pUC19/Msp I (размер фрагментов от 501 до 26 bp). Результаты. При анализе электрофореграммы на дорожках от обоих образцов с мутациями четко визуализируются основной фрагмент, соответствующий дикому типу, а ниже тонкой полосой — продукты соответствующие мутантным аллелям (на уровне примерно 120bp). Дополнительно визуализируются по 2 полосы выше фрагмента дикого типа, соответствующие гетеродуплексам (на уровне 200 и 250 для пациента с мутацией N542-E543 del и на уровне 180 и 200 для пациента с мутацией I540-E543delinsKK). При анализе чувствительности данной технологии с использованием разведенных заклонированных образцов, несущих выявленные ранее мутации в концентрациях 6,25%, 12,5%, 25%, 50% и 100% гетеродуплексы визуализируются при всех выбранных разведениях ДНК образцов с мутациями N542-E543del и I540-E543delinsKK. Одновременно, в обоих случаях визуализируется соответствующая мутантному аллелю полоса, начиная от уровня аллельной нагрузки 12,5%. Вывод. Предлагаемый подход с использованием метода вертикального электрофореза в ПААГ достаточно хорошо подходит для выявления, по крайней мере, двух различных мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 с чувствительностью от 6% мутантного аллеля в пробе. Поскольку обе мутации связаны с делецией 6-ти нуклеотидов, то можно предположить, что также хорошо данный метод будет выявлять любые делеции и/или вставки в 12-м экзоне гена JAK2 имеющее диагностическое значение.
