Определение мутаций в гене JAK2 критично для дифференциальной диагностики Ph-негативных хронических миелопролиферативных опухолей (ХМО). Наиболее часто используемым диагностическим критерием ХМО, является обнаружение мутации V617F (rs77375493) в 14-м экзоне JAK2. Другой причиной Ph-негативных ХМО, в частности истиной полицитемии, могут являться мутации, возникающие в фрагменте 12-го экзона гена JAK2. В отличие от точечной мутации V617F в 14-м экзоне гена, в области 12-го экзона описано более 40 различных вариантов клинически значимых мутаций, выявляемых с различной частотой. Удобным методом определения соматических мутаций и количественной оценки доли мутантных аллелей является пиросеквенирование. В связи с этим нами разработан ряд методик, направленных на определение мутаций в 12-м и 14-м экзонах JAK2. Для определения мутации V617F разработана методика количественной оценки доли мутантного аллеля, позволяющая детектировать мутантный аллель в количественном формате начиная с 7%, при этом «серая зона» методики составила от 4 до 7%. При исследование выборки из 192 клинических образцов, полученных от пациентов с подозрением на ХМО, мутация была выявлена в 64 пробах (доля мутантного аллеля находилась в диапазоне от 13 до 91%). Поскольку чувствительность методов, используемых в лабораторной практике для определения мутаций в гене JAK2, влияет на раннюю диагностику, выбор тактики лечения и определение минимальной остаточной болезни, были разработаны более чувствительные тесты, направленные на детекцию мутации V617F, за счет избирательной амплификации мутантной ДНК с помощью аллель-специфичной ПЦР и COLD-ПЦР. Предложенные методики не предполагают количественного определения доли мутантного аллеля, но позволяют детектировать 0,25% мутантного аллеля (в концентрации 103 и выше копий ДНК/мкл) для аллель-специфичной ПЦР и 0,5% (в концентрации не менее 104 копий ДНК/мкл) для COLD-ПЦР. С помощью разработанных методик были дополнительно выявлены мутации в 15 (аллель-специфичной ПЦР) и 13 (COLD-ПЦР) образцах из 106 проб пациентов с подозрением на ХМО, охарактеризованных ранее с помощью стандартного протокола «АмплиСенс Пироскрин» как отрицательные или сомнительные. Для выявления различных вариантов мутаций в фрагменте 12-го экзона JAK2 разработана методика секвенирования фрагмента гена длиной 50 пар оснований (соответствуют аминокислотной последовательности белка с 532 по 547) с использованием опции SQA программного обеспечения прибора PyroMark Q24 («Qiagen», Германия), позволяющей анализировать все возможные генетические изменения, встречающиеся на данном участке, при последовательном добавлении каждого из четырех нуклеотидов в реакционную смесь. С помощью разработанной методики было проанализировано 56 образцов ДНК от пациентов с эритроцитозом и высоким уровнем гемоглобина. В двух образцах были найдены мутации N541-E543del и I540-E543delins и определены доли мутантных аллелей. Оба положительных образца были получены от пациентов с клинической картиной истинной полицитемии, диагноз которой был также подтвержден морфологическим исследованием трепанобиоптата костного мозга. В настоящее время продолжается клиническая апробация предложенного комплекса методик, основанных на пиросеквенировании, для диагностики новых случаев и мониторинга выявленных Ph-негативных ХМО.
