Разработка метода определения аллельной нагрузки соматической мутации V617F в гене JAK2 (янус-киназы-2) в пулах проб венозной крови

Выявленная в 2005 г. [9] соматическая мутация V617 °F в гене янус-киназы 2 (JAK2) приводит к активации JAK-STAT сигнального пути независимо от его физиологической рецепторной регуляции. Обусловленная данной мутацией пролиферативная активность миелоидного ростка кроветворения играет важную роль в патогенезе хронических Ph-негативных миелоидных опухолей. Тест на выявление мутаций гена JAK2 с 2008 г. включен в клинические рекомендации ВОЗ в качестве одного из основных диагностических критериев [18]. Одновременно было продемонстрировано, что распространенность мутации V617 °F JAK2 среди большой выборки добровольцев, не имеющих онкогематологического заболевания, составляет от 0,15 до 1,2% [10, 13, 21], что значительно превышает официально регистрируемую заболеваемость населения хроническими миелоидными опухолями (0,002—0,02%) [19]. Показано, что носительство мутации V617 °F JAK2 приводит к независимой от уровня циркулирующих клеток крови активации тромбоцитов [4] и значительно увеличивает риск как артериальных, так и венозных тромбозов [15]. Кроме того, мутация V617 °F JAK2 выявляется при тромбозах сосудов головного мозга в 3,8—6,6% случаев [7, 14], тромбозах висцеральных вен кишечника около 16% и до 40% случаев при синдроме Budd-Chiari [16, 20]. В связи с этими данными предполагается, что большинство пациентов с мутацией V617 °F JAK2 не доживают до развернутой картины гематологического диагноза и обсуждается вопрос о целесообразности проведения скрининга для раннего выявления этой мутации.

В Российской Федерации на декабрь 2015 г. из трех представленных на рынке наборов для выявления данной мутации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве изделия медицинского назначения зарегистрирована только одна диагностическая тест-система Jak2V617F-тест производства ООО «ГеноТехнология» [2]. «Комплект реагентов для выявления полиморфизма V617 °F в гене JAK2» производства ООО «НПФ Литех» имеет Подтверждение соответствия технической документации требованиям директивы 98/79/ЕС (http://www.lytech.ru/license.htm). Коммерчески доступен также «Набор реагентов для определения мутации V617 °F гена JAK2» ООО «НПК Синтол». При этом отсутствуют сведения о возможности использования этих наборов для скринингового исследования V617 °F JAK2 в пулированных образцах. Одним из основных требований к работе с пулами является достаточный порог аналитической чувствительности теста в присутствии избытка не имеющей искомой мутации ДНК, собранной от разных пациентов. В международной практике существуют процедуры регламентации допуска к клиническому использованию наборов реактивов для молекулярно-генетической диагностики, приготовленных непосредственно в лаборатории — «in house» методы [17].

Целью настоящей работы явилось сравнение результатов анализа мутации V617 °F JAK2, полученных при использовании разработанного метода и коммерческих наборов российских производителей, а также демонстрация возможности использования разработанной методики для анализа указанной мутации в пулированных образцах венозной крови.

При разработке метода учитывались рекомендации по детекции мутации V617 °F JAK2 [5]. С целью выявления мутации V617 °F JAK2 использовали собранный в нашей лаборатории набор реактивов для метода аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Использовались праймеры, указанные в работе [15]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала праймеры в концентрации 0,3 мМ, зонд 0,2 нМ (ООО «ДНК-синтез»), 2 мМ MgCl2 (ООО «НПК Синтол»), 0,25 мМ дНТФ (ООО «НПК Синтол»), 1xTaq буфер для амплификации (ООО «НПК Синтол») и 1 ед. активности Syn Taq-полимеразы (ООО «НПК Синтол»). Программа амплификации: активация фермента — 10 мин 95 °C, 50 циклов: денатурация — 95 °C 15 с, отжиг/элонгация — 60 °C 60 с. Количество вносимой ДНК  — 40—60 нг.

Указанные в работах [1, 11] специфические праймеры заказывали в OOO «ДНК-Синтез», остальные компоненты реакционной смеси и ДНК-полимеразу — в ООО «НПК Синтол». Реакция была оптимизирована для выполнения анализа на амплификаторе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США). Пороговый выход кривых амплификации ПЦР-РВ (Сq) определяли методом Cy0 [8]. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с использованием реагента «ДНК-экспресс-кровь» (ООО «НПФ Литех»), а также с использованием набора «ДНК-Сорб-В» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»). Концентрацию ДНК в образцах, полученных при выделении набором «ДНК-Сорб-В», измеряли с использованием набора «dsDNA HS Assay Kit» на флюориметре Qubit («Invitrogen», США).

С целью определения сравнительных характеристик чувствительности и специфичности тестирования были использованы образцы 886 проб венозной крови (из них 308 с мутацией V617 °F JAK2) от пациентов, направленных врачами-гематологами в период с 2012 по 2015 г. для обследования в лабораторию Красноярского филиала ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России в связи с подозрением на хронические миелоидные опухоли. Все образцы ранее были протестированы на наличие мутации V617 °F JAK2 с использованием наборов ООО «НПФ Литех». Из всех выбранных образцов 35 были исследованы дополнительно с использованием наборов ООО «НПК Синтол», 25 — с использованием наборов ООО «ГеноТехнология» и 45 — в реакции пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) с использованием набора реагентов «АмплиСенс Пироскрин», «Тромбо-скрин» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии») в количественной модификации [2].

С целью отработки методики тестирования пулированных образцов в исследование включили 1323 анонимных пробы венозной крови пациентов КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» и НУЗ «Дорожная клиническая больница ст. Красноярск ОАО «РЖД», собранных в период с июня по декабрь 2015 г. Процедуру пулирования проводили после выполнения гематологического исследования на анализаторе Sysmex XT-2000i (Япония) для обеспечения равного соотношения ядросодержащих клеток в приготовленном пуле. Каждый пул включал 7 отдельных образцов крови пациентов.

Для проведения статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0. Описательная статистика представлена в виде значений медианы (Ме). Для оценки корреляционных связей использовали непараметрический метод Спирмена.

Для оценки предела аналитической чувствительности молекулярно-генетического теста принято использовать подходы, основанные на выявлении искомой мутации при последовательном разведении стандартных образцов с известным и гарантированным количественным уровнем соотношения дикого и мутантных аллелей. В качестве таких образцов могут выступать охарактеризованные в референс-лабораториях клинические образцы или клеточные культуры с известным уровнем аллельной нагрузки [1, 3, 5]. При этом важным требованием к среде для разведения образцов является присутствие в ее составе соответствующего количества ДНК с «диким» аллелем для учета чувствительности теста к показателю соотношения аллелей в условиях существенного избытка молекул ДНК без искомой мутации. Стандарты, основанные на образцах ДНК, полученных из культур клеток, также требуют систематического контроля реальных значений аллельной нагрузки, поскольку даже в стандартных условиях культивирования in vitro существует риск утраты стабильности клона [6].

Весьма распространенным вариантом оценки порога чувствительности тест-систем является метод разведения специфических «ДНК-векторов», содержащих мутацию, однако данный подход также не является идеальным, поскольку сопряжен с потерей фактора влияния на эффективность ПЦР полногеномной ДНК.

Еще одним способом оценки порога чувствительности может являться описанный A. Bench и C. Martinaud [5, 12] метод, основанный на определении параметров накопления флюоресцентного сигнала в пробах с заведомым отсутствием искомой мутации в связи с образованием неспецифического продукта амплификации на поздних стадиях ПЦР. Полученные таким образом значения расчетной аллельной нагрузки позволяют определить вероятность получения ложнопозитивного результата при заданном пределе аналитической чувствительности метода.

С целью определения уровня выхода неспецифического сигнала при амплификации мутантного аллеля в нашей версии «in house» теста было исследовано 589 проб венозной крови с ничтожно малой вероятностью обнаружения данной мутации. В данную группу были включены пробы 18 здоровых студентов-добровольцев моложе 25 лет, а также пациенты без клинического подтверждения диагноза и с отсутствием мутации при тестировании коммерческими тест-системами. По полученным значениям разницы пороговых циклов (Cq) дикого и мутантного аллелей в реакции ПЦР-РВ этих проб рассчитывали уровень предполагаемой аллельной нагрузки по формуле:

где Cqдик — пороговый цикл дикого аллеля, Cqмут — пороговый цикл мутантного аллеля.

В соответствии с полученными данными (рис. 1) для проб с заведомо отрицательным результатом, гарантирующим их попадание в область отрицательных значений с вероятностью 99,999% (6σ), граница предела уверенного определения аллельной нагрузки находится на уровне 0,06%, что соответствует вероятности ложноположительного результата в 0,00034% случаев.

В качестве контроля количественного теста были использованы пробы пациентов, исследованные ранее в референсной лаборатории доктора A. Vannucchi (Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Италия), которые позволили убедиться в совпадении результата с результатами, полученными в методе «in house».

Способ выделения ДНК не оказывал существенного влияния на результат тестирования набором «in house», коэффициент корреляции результатов определения аллельной нагрузки в образцах ДНК, выделенных с использованием реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» или набора «ДНК-сорб-B» («АмплиПрайм»), составил 0,96 (p<0,01), R2 =0,93 (рис. 2).

Результаты тестирования проб венозной крови «in house» методом аллель-специфической ПЦР-РВ продемонстрировали высокую достоверную корреляцию по сравнению с результатами, полученными при тестировании данных проб с использованием коммерческих ПЦР тест-систем ООО «ГеноТехнология» и ООО «НПК Синтол», а также методом количественного пиросеквенирования (рис. 3).

Вместе с тем результаты тестирования проб набором «in house» в сравнении с результатами, полученными при параллельном тестировании проб с использованием коммерческой тест-системы ООО «НПФ Литех», выявили существенное расхождение (см. таблицу).

Из таблицы следует, что если при интерпретации результатов тестирования строго придерживаться инструкции производителя набора ООО «НПФ Литех», то 44 (47,3%) из 93 положительных проб будут расценены как отрицательные или неинтерпретируемые. При этом уровень аллельной нагрузки V617 °F JAK2 находился в пределах от 0,07 до 29,9%, (Ме =8,2%) в группе неинтерпретируемого результата и от 0,06 до 2,0%, (Ме =0,26%) в группе отрицательного результата. Одной из причин выявленного расхождения следует считать ошибочно используемый в инструкции к набору ООО «НПФ Литех» подход к оценке аллельной нагрузки соматической мутации как к результату определения генетического полиморфизма «гомозиготность—гетерозиготность».

Ввиду высокой аналитической чувствительности теста, достаточной для выявления клинически значимых уровней аллельной нагрузки данной соматической мутации (1—3%) [5, 13] даже в многократно разведенных «диким» аллелем ДНК пробах, было проведено скрининговое исследование, направленное на оценку распространенности мутации среди пациентов медицинских учреждений, не имеющих на момент обследования онкогематологического заболевания. В результате данной работы было проведено исследование 1323 предварительно пулированных образцов венозной крови. Были выявлены 8 пулов с положительными результатами (уровень аллельной нагрузки выше 0,06%). При последующем тестировании проб, входящих в данные пулы, были выявлены 11 образцов с уровнями аллельной нагрузки от 0,24 до 40,4%. При контрольном исследовании 49 проб, входящих в 7 отрицательных пулов, не выявлено ни одной пробы с данной мутацией, что подтверждает достаточную чувствительность и специфичность «in house» теста в рамках используемого протокола пулирования образцов.

Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрирована высокая корреляция результатов использования «in house» метода аллель-специфической ПЦР-РВ для определения мутации V617 °F JAK2 с основными коммерческими тест-системами количественной ПЦР российского производства, а также возможность использования разработанной диагностической тест-системы для тестирования в пулах образцов венозной крови при проведении скрининговых исследований.

Благодарности

Авторы выражают признательность студентам Сибирского федерального университета, оказавшим помощь в проведении данного исследования и ставшим донорами крови, руководству и сотрудникам КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» и НУЗ «Дорожная клиническая больница ст. Красноярск ОАО «РЖД» за предоставленные пробы крови пациентов, а также профессору A. Vannucchi (Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Италия) за проведение подтверждающих тестов в референс-лаборатории.

Конфликт интересов отсутствует.

Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ СО РАН и СФУ, фонд инноваций общественной организации «МедЛабДиагност».