В последние годы на рынке появилась группа лабораторных микроскопов-сканеров (МС), автоматизирующих процесс формирования высококачественных цифровых копий препаратов биоматериалов - виртуальных слайдов (ВС). ВС применяются для визуального анализа на мониторе компьютера с использованием средств информатики, значительно повышающих производительность труда исследователя. МС автоматизирует этапы загрузки, идентификации, картирования, определения области сканирования, сканирования препарата. Обслуживание МС может выполнять младший персонал с минимальными трудозатратами. Возможно формирование двухмерных или трехмерных ВС для анализов биоматериалов большинства типов с применением микроскопии разных типов, любых увеличений, с иммерсионным маслом, под покровным стеклом, в камерах и т.д. В состав МС входит моторизованный управляемый компьютером микроскоп, видеокамера, компьютер и программное обеспечение. Дополнительно могут применяться загрузчик препаратов, устройство для нанесения иммерсионного масла (ойлер), станция макросъемки, сканер штрих-кода, сервер и др. ВС в форме сплошной панорамы с разрешением, близким к разрешению в окулярах, без искажений и потерь на стыках кадров формируются в форматах, соответствующих стандартам телеморфологии (телемедицины), что позволяет их визуализировать известными вьюерами на компьютерах удаленных пользователей. Обработка препарата в современном МС обычно не превышает 1-4 мин. МС освобождает врача от наиболее трудоемкой рутинной части анализа, связанной с процессом микроскопии, создавая рабочее место с эффективной эргономикой и возможностью консультаций виртуальных слайдов по Интернету. Для анализа ВС разработана группа специализированных программных анализаторов (СПА), выполняющих анализ морфологии и/или биомаркеров в ВС в соответствии с задачами конкретных методик анализа. Для препаратов с низкой концентрацией объектов анализа применяются специализированные комплексы МС-СПА, в которых СПА участвуют в процессе сканирования.

В таблице

В настоящей статье рассмотрены основные потребительские характеристики МС, МС-СПА и СПА.

Современные МС, МС-СПА и СПА предназначены в основном для работы с препаратами, приготовленными по стандартизированным известным технологиям для обычного визуального анализа при ручной микроскопии. Качество (точность следования рекомендациям известных руководств) препарата сказывается главным образом на качестве работы МС-СПА и СПА. Работа МС-СПА или СПА может быть нарушена при неправильном распределении материала на площади стекла и неправильной окраске. Поскольку рекомендации известных руководств в большинстве случаев допускают значительную изменчивость качества препарата при затрудненном контроле, некоторые производители рекомендуют для работы с МС-СПА и СПА применение автоматизированных устройств пробоподготовки, уменьшающих изменчивость качества [7]. Применение автоматизированных устройств пробоподготовки кроме иногда значительного увеличения стоимости анализа может не обеспечивать однотипность пробоподготовки в особых случаях (например, мазки крови новорожденных) или при поступлении материала в лабораторию из разных источников. Устойчивая работа МС-СПА (СПА) в условиях вариабельности обычной дешевой пробоподготовки является одной из главных характеристик МС-СПА (СПА), определяющей пригодность для работы в рядовой лаборатории. Функция автоматической адаптации МС-СПА может быть реализована в виде адаптации СПА к конкретным размерам, форме, толщине препарата, ориентированной на вариабельную пробоподготовку и в виде адаптации к серии препаратов, учитывающей особенности

пробоподготовки (окраски) в конкретной лаборатории. Некоторые МС-СПА (СПА) имеют собственный автоматический контроль качества препарата, с записью в базу данных соответствующих сообщений в случаях выхода характеристик препарата за пределы возможностей автоматической адаптации [10, 11].

Качество производства ВС в МС более устойчиво и зависит от геометрических и оптических характеристик препарата (качество стекол/камер, равномерность толщины биоматериала). Равномерность толщины биоматериала в препарате определяет скорость сканирования при изготовлении ВС и производительность МС. Высококачественные тонкие препараты с равномерной толщиной позволяют использовать в МС скоростной вариант сканирования с небольшим числом фокусировок ("predictable focus") [1, 5, 8, 11], препараты с неравномерной толщиной приходится сканировать с регулярной фокусировкой (при изготовлении 2D ВС) или изготавливать "толстый" 3D ВС [11]. Скорость изготовления 2D ВС с регулярной фокусировкой и 3D ВС значительно ниже, чем с predictable focus. При изготовлении гистологических срезов рекомендуется использовать высококачественные микротомы, обеспечивающие равномерную толщину препарата.

В случае применения мазков и препаратов под покровными стеклами в МС может использоваться автоматическое картирование препарата для последующего автоматического или диалогового определения на карте (макроизображение стекла) области сканирования для производства ВС. В некоторых МС для производства карты применяется макросъемка с освещением стекла сверху [1, 11]. Это позволяет зафиксировать надписи на стекле на непрозрачных наклейках и использовать карту для идентификации препарата и областей анализа. Идентификация препаратов может осуществляться также по наклейкам со штрих-кодом на предметном стекле или пробирке с текучим биоматериалом с использованием встроенного автоматического или подключенного к МС ручного сканера штрих-кода.

При производстве ВС текучих толстых 3-мерных препаратов (препараты фекалий, мочи, спермы, других биожидкостей) рекомендуется применение специализированных герметичных камер. Эффективны проточные слайд-камеры с автоматической промывкой после анализа [4, 11, 12]. Помимо гигиенических преимуществ благодаря точной геометрии камер отпадает необходимость в картировании препарата для определения области сканирования с сокращением времени автоматического обслуживания. Эффективность работы СПА повышается также с применением при подготовке биоматериала

специализированных фильтрующих концентраторов [11, 13].

В целом современный уровень требований к пробоподготовке со стороны МС, МС-СПА и СПА можно считать необременительным по трудозатратам и финансам. В то же время при изготовлении препаратов необходима строгая дисциплина и тщательный контроль за точным соблюдением требований руководств по эксплуатации.

Загрузка в МС или в МС-СПА одновременно партии препаратов для автоматического обслуживания в одном сеансе без участия оператора осуществляется в разных моделях с применением различных предметных столов микроскопа или использованием роботизированных загрузчиков стекол на предметный стол. Разными производителями предлагаются модели МС и МС-СПА с одновременной установкой на рабочем столе микроскопа от 1 до 12 стандартных предметных стекол [4, 6, 7, 10, 11]. Автоматическое обслуживание осуществляется перемещением стола с размещением последовательно всех стекол партии под сенсором сканера штрих-кода (опция), под видеокамерой макросъемки (опция), под автоматическим ойлером иммерсионного масла (опция) и под объективом микроскопа. Могут применяться как сухие, так и текучие препараты в камерах или под покровным стеклом. Благодаря близкому расположению стекол друг к другу дополнительные затраты времени на перемещение от препарата к препарату в таких моделях МС и МС-СПА малы.

Применение МС и МС-СПА с загрузчиками стекол [1, 5-11] позволяет автоматически обслуживать большие партии препаратов, но значительно увеличивает стоимость системы и несколько снижает пропускную способность по сравнению с моделями предыдущей группы. Не могут использоваться текучие препараты. Оператор размещает стекла в контейнерах загрузчика (до 50-400 стекол в разных моделях). В автоматическом режиме работы МС (МС-СПА) последовательно перемещает стекла из контейнеров на рабочий стол микроскопа для выполнения операций идентификации, картирования, сканирования препарата и возвращает их обратно после выполнения операций. Для уменьшения времени перезагрузки препаратов в некоторых моделях используется предварительное перемещение нескольких следующих стекол в промежуточный буфер, расположенный близко к рабочему столу. Высокая стоимость моделей с загрузчиком связана с высокими скоростями и высокой точностью траекторий перемещения стекол.

Идентификация препаратов может осуществляться по штрих-коду автоматически при применении встроенного сканера штрих-кода (штрих-код на предметном стекле) или интерактивно при применении подключенного ручного сканера. При отсутствии штрих-кода идентификация результатов анализа в базе данных может осуществляться по карте стекла в случае макросъемки [1, 11]. При отсутствии макросъемки и штрих-кода используется диалоговая идентификация стекол, выполняемая оператором перед или в процессе размещения препаратов на предметном столе или в контейнерах загрузчика.

Автоматическое картирование (формирование карты - изображения всего предметного стекла без или с малым увеличением) применяется в МС для автоматического или интерактивного выбора области исследований на препарате. При применении слайд-камер с текучим биоматериалом картирование из-за фиксированного расположения камеры на предметном столе микроскопа может не применяться. Для автоматического картирования МС выполняет либо сканирование всей площади предметного стекла на малом увеличении (×4 или ×10) в проходящем свете с применением микроскопа и формированием в качестве карты 2D ВС, либо выполняет макросъемку стекла с использованием дополнительной видеокамеры ("станция макросъемки") с освещением сверху. Картирование занимает мало времени благодаря большой площади съемки и большой глубине фокуса, позволяющей избегать фокусировок.

Вариант со съемкой карты через микроскоп имеет преимущество в разрешении, для некоторых видов анализа существенно улучшающий выбор на карте области анализа (мазки гинекологические, на микобактерии и др.). Преимущество макросъемки состоит в значительно большей скорости и сохранении на карте информации, нанесенной на непрозрачных наклейках.

В специализированных системах МС-СПА для анализов мазков крови вместо формирования полной карты в процессе специального автоматического этапа сканирования мазка на малом увеличении определяется стартовая точка с заданной плотностью расположения эритроцитов для основного этапа сканирования на большом увеличении.

Области сканирования для формирования ВС могут быть выбраны на карте в автоматическом или диалоговом режиме (рис. 1

В некоторых МС предлагаются автоматические средства выделения на карте контрастных границ всех фрагментов биоматериала [1, 11]. Выделенные области могут состоять из нескольких несвязных подобластей, при этом МС формирует единый ВС для всех выделенных подобластей. Автоматически могут быть выделены также границы покровного стекла [11], что может позволить избежать диалогового анализа карты при применении текучих препаратов (биожидкости, фекалии). Как правило, удается автоматически выделить только контрастные границы всего материала на стекле или компактные части материала со специфической окраской. Время сканирования при производстве ВС приблизительно пропорционально площади сканирования и квадрату увеличения выбранного объектива:

Tscan = К∙S∙Mag²,

где К - коэффициент, зависящий от скоростных характеристик конкретного МС, S - площадь сканирования,Mag - увеличение объектива.

Если площадь выделенных областей значительна, то время формирования ВС может быть неприемлемым на объективах с большим увеличением (например, если сканирование площади покровного стекла 15×15 мм на ×20 составляет 1 мин, то на ×100 составляет около 25 мин). Поэтому из-за обычно большой площади автоматически выделенных фрагментов с контрастными границами или определенных границами покровного стекла ВС таких препаратов формируется на небольшом увеличении (×20, ×40), что подходит для большой группы анализов (окрашенных гистологических, иммуногистохимических маркеров, фекалий на паразиты, осадка мочи по Нечипоренко и др.). При необходимости выполнять анализ на большом увеличении (гинекологические мазки, анализы на микобактерии, на малярийный плазмодий и т.д.), чтобы сделать приемлемым время формирования ВС, как правило, приходится использовать не весь материал. Для этого пользователь может применить средства интерактивного выделения области анализа (см. рис. 1

Во многих случаях автоматические процедуры выделения на картах областей анализа неэффективны или недостаточны (особенно на мазках и отпечатках разных типов). Для таких препаратов также используется интерактивное выделение на карте области анализа. Предлагаются полуавтоматические средства быстрого выделения области заданной площади. Может осуществляться интерактивная редакция границ автоматически выделенных областей. При выборе области оператор может использовать сохраненные на карте графические указания на предметном стекле (например, метки областей U, V, C на гинекологическом мазке).

При автоматическом выделении областей анализа этапы формирования карт, выделения областей анализа и формирования ВС выполняются

в одном автоматическом сеансе для всей партии загруженных в СМ препаратов без участия опе­ратора.

Для интерактивного выделения областей анализа на картах необходима организация специального сеанса работы оператора с базой данных. Поэтому автоматическое обслуживание стекол с их перемещением на предметном столе микроскопа приходится выполнять 2 раза: 1-й раз на этапе автоматического формирования карт партии и 2-й раз на этапе автоматического формирования ВС партии после интер­активного сеанса выделения областей анализа на картах.

Сканирование предварительно определенной области анализа для формирования ВС выполняется в МС в автоматическом режиме с использованием заданных параметров сканирования (объектив; тип ВС (2D, 3D); тип фокусировки при формировании 2D ВС).

При сканировании тонких препаратов (толщина меньше глубины фокуса применяемого объектива) формируется 2D ВС с единственным слоем изображения.

Для тонких препаратов разных типов могут применяться разные режимы фокусировки при изготовлении 2D ВС, отличающиеся скоростью сканирования [1, 11]:

1) режим "predictable focus" с автоматическим предварительным выполнением небольшого числа автофокусировок, с формированием плоскости фокуса, с перемещением при сканировании в плоскости фокуса без промежуточных автофокусировок. Режим эффективен для препаратов с равномерной толщиной;

2) режим с регулярной автофокусировкой по сканируемой площади. Фокусировки выполняются в каждом n-м поле зрения. Может применяться для препаратов с изменчивой толщиной. При n=1 режим гарантирует качественный фокус по всей площади ВС, но время сканирования может увеличиваться в несколько раз по сравнению с predictable focus.

Выбор варианта фокусировки, включая выбор значения n, зависит от типа и качества подготовки препаратов в лаборатории и должен выбираться пользователем экспериментально.

При сканировании толстых препаратов формируется 3D ВС заданной толщины со стопкой сдвигов по Z в каждом поле зрения съемки. Число сдвигов по Z, каждый из которых меньше глубины фокуса, подбирается автоматически или фиксируется заранее [11].

После съемки выполняется формирование непрерывной панорамы ВС, запись в базу данных Карт и ВС в форматах телеморфологии (24-битный TIFF (SVS)/JPG/JP2).

В МС и МС-СПА эффективно применение иммерсионных объективов и автоматического ойлера для нанесения иммерсионного масла. Объективы ×20 oil, ×40 oil, ×50 oil со значительно большей апертурой, чем соответствующие сухие, позволяют достигнуть большей скорости сканирования при аналогичном разрешении, что особенно важно при больших площадях анализа. Автоматизация масляной микроскопии в МС позволяет повысить конкурентоспособность некоторых старых методик анализа в проходящем свете по сравнению с люминесценцией за счет меньшей стоимости МС и пробоподготовки, сравнимой скорости анализа (например, анализы на микобактерии с окраской по Цилю-Нильсену [11]).

Необходим тщательный контроль качества ВС и полученной в МС-СПА цифровой модели препарата, от которого зависит сама возможность замены анализа натурального препарата анализом его цифровой копии. Один из путей контроля - сравнительные испытания с прямой микроскопией, проведенные для ряда систем СПА [14, 15].

Визуальный анализ размещенного в базе данных ВС может производиться локально на экране соответствующего МС или дистанционно через локальную сеть или Интернет на компьютере удаленного пользователя. Могут использоваться специализированные или универсальные общедоступные вьюеры Интернета. ВС можно быстро просматривать с любым уменьшением масштаба изображения относительно изображения съемки при сканировании, что позволяет ускорить навигацию по препарату.

В специализированных вьюерах (фактически СПА) возможна навигация по карте (рис. 2

Просмотр ВС может сопровождаться редакцией с внесением текстовых и графических комментариев, предоставляются средства измерения объектов (размеры, площадь, форма, оптическая плотность), возможно формирование результатов анализа на предустановленных или настраиваемых бланках.

Автоматический анализ ВС в СПА

Программное обеспечение СПА может быть установлено как на МС, так и на компьютере удаленного пользователя, импортирующего ВС из базы данных МС. Возможен также облачный вариант применения СПА с доступом к нему пользователя через Интернет.

Разные СПА выполняют специализированные виды анализа изображений всего ВС или заданных фрагментов ВС [2-4, 11]. СПА формируют для визуального контроля своих автоматических функций анализа графические метки и отдельные галереи изображений автоматически найденных объектов.

При количественном анализе всей заданной площади ВС без выделения границ объектов (например, при анализе иммуногистохимических маркеров) СПА может визуализировать результаты количественного анализа в отдельном окне, которое может быть просмотрено одновременно с окном просмотра исходного ВС.

В МС-СПА для анализа мазков крови применяется оборудование, во многом сходное с МС общего назначения для микроскопии светлого поля.

В связи с особым режимом поиска области анализа (стартовой точки) картирование всего стекла не применяется. Используется автоматический ойлер нанесения иммерсионного масла. Для анализа эритроцитов (RBC) и тромбоцитов (PT) формируется небольшой ВС заданного размера в области стартовой точки с ненарушенной морфологией RBC. Основное отличие МС-СПА от МС состоит в разном характере просмотра препарата для сбора выборки лейкоцитов (WBC): вместо сплошного сканирования всей площади области анализа и формирования ВС с помощью СПА выполняется просмотр мазка по специальным траекториям сбора представительной выборки WBC с учетом специфики распределения слоя эритроцитов в данном мазке крови. Специальные траектории просмотра, соответствующие рекомендованным в известных руководствах по гематологии, позволяют значительно сократить время сканирования, необходимое для формирования представительной выборки WBC по сравнению с поиском WBC в сплошном ВС.

Объем сканирования определяется концентрацией WBC и заданным объемом выборки WBC.

В специальном режиме сканирования определяющими являются концентрация и объем выборки PT [11].

Важной характеристикой МС-СПА является точность автоматической сортировки изображений WBC по типам. В настоящее время почти безошибочно сортируются нормальные типы и со значительной ошибкой - юные и атипичные клетки. Если клеток нормальных типов большинство, контрольный просмотр врачом сортированных галерей изображений клеток на экране компьютера благодаря эффективной эргономике занимает значительно меньше времени, чем анализ при ручной микроскопии мазка (рис. 3

В противном случае врач тратит до 1-2 мин на исправление ошибок автоматической сортировки.

Кроме анализа WBC МС-СПА выполняют углубленный полуколичественный анализ морфологии RBC и PT, практически не осуществимый при ручной микроскопии.

Применение МС-СПА увеличивает чувствительность методики к появлению атипичных и юных форм благодаря увеличению выборки до 200-300 WBC.

Современные МС и МС-СПА снабжены сходными стандартизованными средствами удаленного доступа к базе данных проведенных исследований, включая доступ к картам, ВС и другим цифровым моделям препаратов. Удаленный доступ может осуществляться по локальной сети или через Интернет, может применяться Интернет-ресурс коллективного доступа. Возможно также прямое дистанционное управление МС. Например, удаленный пользователь может сам выбрать на карте загруженного стекла область анализа для формирования ВС и инициировать изготовление ВС. Современные средства удаленного доступа дешевы, просты и могут широко применяться для консультаций, коллективного обслуживания потока анализов и контроля качества. Высококвалифицированные специалисты могут дистанционно, независимо от географии, в условиях комфортабельного компьютерного рабочего места осуществлять просмотр виртуальных слайдов, инициировать СПА, корректировать результаты автоматического анализа МС-СПА и СПА, формировать заключения, осуществлять контроль качества работы местного персонала, обслуживающего МС или МС-СПА в удаленной лаборатории. В большинстве случаев не предъявляется высоких требований к скорости Интернета. Организация коллективного обслуживания потока анализов удаленными специалистами требует минимальных организационных усилий от местных органов здравоохранения.

МС, СПА, МС-СПА имеют следующие преимущества по сравнению с ручной микроскопией и/или анализаторами других типов:

- автоматическая загрузка и идентификация препаратов;

- автоматическое картирование и выбор области анализа;

- автоматическая адаптация к индивидуальным особенностям препарата в условиях рутинной пробоподготовки;

- ранее недоступный объем анализируемого материала;

- автоматическое обнаружение, сортировка и визуализация объектов анализа;

- автоматическое формирование компактной представительной цифровой модели препарата для визуального контроля;

- количественные оценки популяции;

- дешевая пробоподготовка и обслуживание;

- средства коллективного локального и дистанционного обслуживания потоков биоматериалов, телемикроскопия и телеморфология;

- множество комплектаций МС + СПА, МС-СПА для лабораторий с разным бюджетом, нагрузкой и специализацией;

- многофункциональность снижает стоимость и оптимизирует загрузку рабочих мест;

- обслуживание младшим персоналом с минимальными трудозатратами.

Системы МС, СПА, МС-СПА могут применяться в медицинских, ветеринарных, производственных, исследовательских целях.

Применение МС, СПА, МС-СПА не только повышает производительность труда, но и за счет увеличения объема и точности анализа исследуемого материала увеличивает чувствительность методик, создавая условия для более точной или ранней диагностики. Возможна идентификация редких объектов, практически не обнаруживаемых при рутинной ручной микроскопии. Разнообразие СПА и

МС-СПА постоянно растет, охватывая в настоящее время значительное число массовых методик медицинских микроскопических анализов.

Экономический аспект применения технологий сканирующей микроскопии связан с расширяющимся рынком, дешевой эксплуатацией, высокой надежностью, широким кругом потребителей, более эффективным использованием высококвалифицированного персонала, возможностью коллективно дистанционно через Интернет обслуживать потоки анализов удаленных лабораторий, с экономикой более точной и ранней диагностики. Благодаря росту производства цены на МС, СПА, МС-СПА систематически снижаются, достигнув уровня цен массовых анализаторов других типов.

Информация о конфликте интересов: авторы статьи являются сотрудниками ООО "Медицинские компьютерные системы (МЕКОС)".

Источник финансирования написания статьи: ООО "Медицинские компьютерные системы

(МЕКОС)".