Определение показателей системы гемостаза является одним из важнейших направлений клинической лабораторной диагностики. В силу ряда технологических особенностей этот вид анализа подвержен влиянию многих факторов и требует регулярного выполнения внутрилабораторного контроля и внешней оценки качества. Внешняя оценка качества коагулологических исследований в нашей стране осуществляется в пяти разделах Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК), посвященных оценке качества определения процента протромбина по Квику, международного нормализованного отношения (МНО), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), тромбинового времени, фибриногена, антитромбина, факторов VIII, IX, Виллебранда, протеинов C и S, плазминогена, волчаночного антикоагулянта и D-димера.

В настоящей работе представлены алгоритмы оценки качества наиболее широко применяемых в клинической практике коагулологических исследований, выполняемой в разделе ФСВОК "Коагулология", а также результаты многофакторного дисперсионного анализа результатов исследования контрольных образцов участниками данного раздела и изучения зависимости доли неудовлетворительных результатов от уровня определяемых показателей.

В рамках раздела "Коагулология" ФСВОК внешней оценке качества подлежат определения 6 показателей системы гемостаза: процента протромбина по Квику, МНО, АЧТВ, тромбинового времени, фибриногена и антитромбина. Определение протромбинового времени (ПВ) в секундах было признано экспертами ФСВОК нестандартизованным показателем. По этой причине оно не подлежит оценке как самостоятельный показатель, для которого требуется обеспечить единство измерений в разных лабораториях, в отличие от его производных. Тем не менее, результаты определения ПВ запрашиваются наряду с международным индексом чувствительности (МИЧ) тромбопластина и средним нормальным протромбиновым временем (СНПВ) стандартной плазмы с целью контроля правильности вычисления МНО по формуле:

Участники данного раздела получают 3 раза в год наборы контрольных образцов лиофилизированной плазмы крови человека с различными уровнями определяемых показателей. Каждый набор содержит по 2 образца, обозначаемых буквенными индексами "K" и "L". Образцы должны быть исследованы в разные дни (в разных аналитических сериях), по 2 измерения каждого из показателей, определяемых в данной лаборатории (рис. 1

В случае, если "K" и "L" - различные образцы, результаты их анализа оцениваются отдельно. По результатам двух параллельных измерений каждого образца рассчитывают среднее значение (Х) и относительный размах (R) между ними:

где Х1 и Х2 - соответственно результаты 1-го и 2-го измерений определяемого показателя. Величина Х используется для оценки правильности полученных результатов (степени близости среднего к целевому значению; характеризуется величиной относительного смещения), а величина R - для оценки их повторяемости (степени близости результатов измерений между собой).

Величину относительного смещения (B) рассчитывают по формуле:

где ЦЗ - целевое значение, рассчитывается как среднее арифметическое величин Х в группе лабораторий, использовавших одну и ту же методику анализа (или по всем лабораториям, проанализировавшим данный контрольный образец, если код метода/набора реагентов не был указан, отнесен к "прочим" или размер группы оказался менее 5 лабораторий). Если распределение величин Х имеет положительную асимметрию и может быть нормализовано логарифмированием, в качестве целевого значения используется среднее геометрическое. Под методикой, образующей группу, обычно понимают наборы реагентов одного производителя, но в некоторых случаях могут быть исключения, если наборы от одного производителя дают существенно различные результаты, для которых производителем установлены различные референтные интер­валы.

Образец результатов внешней оценки качества для конкретного участника при схеме с двумя различными образцами представляется в виде таблицы и четырех графиков (рис. 2

В случае, если образцы "K" и "L" в наборе представлены одним и тем же пулом плазмы, величина Х рассчитывается по всем четырем результатам измерений:

где XK1 - 1-е измерение образца "K", XK2 - 2-е измерение образца "K", XL1 - 1-е измерение образца "L", XL2 - 2-е измерение образца "L". Целевое значение и смещение среднего (B) рассчитываются так же, как и в предыдущем случае.

Поскольку образцы "K" и "L" исследуются в разные дни, это позволяет рассчитать междневной относительный размах между средними значениями в двух образцах (Q), который используется для оценки воспроизводимости (степени близости результатов измерений образцов "K" и "L", выполненных в разные дни):

где XK и XL - средние значения определяемого показателя в образцах "K" и "L" соответственно, вычисляются по формулам:

Оценкой повторяемости служит средний относительный внутридневной размах (R):

где RK и RL - значения относительных размахов между двумя параллельными измерениями образцов "K" и "L" соответственно, выполненными в один день, вычисляются по формулам:

Образец результатов внешней оценки качества для конкретного участника при схеме с двумя одинаковыми образцами представляется в виде таблицы и трех графиков (рис. 3

По итогам каждого контрольного цикла участники ФСВОК получают общие рекомендации по выявлению источников погрешностей их методик на основании результатов оценки правильности, воспроизводимости и повторяемости.

Неудовлетворительная оценка по правильности (помечена звездочкой величина относительного смещения) означает наличие недопустимо большой систематической погрешности результатов лаборатории. В этом случае рекомендуется проверить прежде всего качество используемых в лаборатории калибровочных образцов, правильность выполнения процедуры калибровки аналитической системы (если методика калибруется по стандартным образцам), стабильность работы измерительных и дозирующих устройств (отсутствие дрейфа), качество реактивов.

Неудовлетворительная оценка по воспроизводимости свидетельствует о нестабильной работе аналитической системы изо дня в день. В основе такого вида нестабильности лежат факторы, которые остаются постоянными в течение дня, но могут случайно меняться день ото дня: калибровка, набор реагентов, температура в помещении и т.п. Кроме того, в междневной размах, определенный по результатам, полученным в разных контрольных образцах, исследованных в разные дни, вносит вклад неточность дозировки воды при растворении лиофилизатов и, возможно, разное ее качество.

Неудовлетворительная оценка по повторяемости означает наличие недопустимо больших различий результатов повторных измерений одного и того же образца, выполненных в одной и той же аналитической серии. В этом случае рекомендуется в первую очередь обратить внимание на показатели, которые могут меняться в течение одной аналитической серии (одного дня) - дозируемый объем образца (нестабильность работы дозирующего устройства), температура реакционной смеси, стабильность показаний прибора, чистота реакционных пробирок и т.п. В случае использования автоматических анализаторов следует обратить внимание на то, сколько времени проба находится в штативе анализатора при 37 °С в ожидании анализа.

При индивидуальной внешней оценке результатов конкретной лаборатории их смещение рассматривается как лабораторная составляющая систематической погрешности методики. Погрешность, связанная с использованием наборов реагентов конкретного производителя, выносится за скобки, поскольку находится вне зоны ответственности лаборатории. Целевые значения для оценки правильности устанавливаются отдельно по каждому набору реагентов или совокупности наборов от одного производителя. Однако, как видно из рис. 2

Схема межлабораторного эксперимента с двумя одинаковыми контрольными образцами может быть описана линейной моделью дисперсионного анализа [1] как сумма погрешностей различного происхождения. Поскольку каждая лаборатория в рамках одного контрольного цикла может использовать только один метод/набор реагентов, а контрольный образец является расходуемым и не может быть проанализирован в разных лабораториях и даже в одной лаборатории в разных аналитических сериях, такая модель дисперсионного анализа называется группированным планом:

где Xijkl - результат l-го измерения в k-й аналитической серии в j-й лаборатории i-м методом/набором реагентов; μ - математическое ожидание измеряемой физической величины (принятое опорное значение); γi - погрешность i-го метода/набора реагентов (i = 1, ..., I), характеризуется коэффициентом межнаборной вариации CVнабор, оценка суммы μ и γi используется в качестве целевого значения: ЦЗ = μ+γi; δij - погрешность j-й лаборатории

(j = 1, ..., Ji), характеризуется коэффициентом межлабораторной вариации CVлаб.; εijk - погрешность k-й аналитической серии (k = 1, ..., Kij), характеризуется коэффициентом междневной вариации CVмеждн;

ζijkl - погрешность l-го измерения (l = 1, ..., Lijk), характеризуется коэффициентом внутридневной вариации CVвнутр.

Дисперсионный анализ позволяет стратифицировать различные компоненты дисперсии таким образом, что дисперсия выборки равна сумме дисперсий от всех включенных в модель источников погрешностей. В модели с пропорциональными ошибками вместо стандартных отклонений используют коэффициенты вариации, а доля того или иного источника в общей погрешности равна доле в процентах соответствующего CV² в квадратичной сумме:

При проведении дисперсионного анализа из расчета были исключены группы результатов, сформированные по признаку набора реагентов, в которых было менее 20 лабораторий, а также результаты, в которых код набора реагентов не был указан или отнесен к "прочим". Тем не менее, репрезентативные группы, вошедшие в расчет, представляют более 90% результатов, как видно на примере МНО (рис. 4

В данной работе представлены результаты, полученные в рамках ФСВОК в 2011 и 2014 г. В 2014 г. в разделе "Коагулология" приняли участие 2094 лаборатории из 7478 участников ФСВОК, а в 2011 г.  - 1842 лаборатории из 7381. В 2014 г. были использованы обе схемы оценки качества: с различными и одинаковыми образцами, и мы имеем возможность сравнить доли результатов, не удовлетворяющих установленным критериям, для различных показателей на разных контрольных материалах. В 2011 г. во всех трех циклах применялась схема с двумя одинаковыми образцами, что позволяет провести дисперсионный анализ результатов в рамках единой линейной модели и сравнить вклад различных источников аналитической погрешности в зависимости от уровня определяемых показателей в контрольных образцах.

В первых двух циклах 2014 г. в контролируемые лаборатории были разосланы наборы контрольных материалов по схеме с двумя различными образцами (табл. 3

Хотя МНО считается наиболее стандартизованным показателем, тем не менее и на его примере было показано, что суммарный коэффициент межлабораторной вариации увеличивается по мере изменения значений МНО в контрольных образцах от нормальных к патологическим (рис. 6

В цикле 3-14 в контролируемые лаборатории были направлены наборы контрольных материалов по схеме с двумя одинаковыми контрольными образцами, в которых уровни определяемых показателей находились в районе границы между нормой и патологией. Доля неудовлетворительных результатов при оценке правильности, воспроизводимости и повторяемости относительно допусков, установленных экспертами ФСВОК, в большинстве случаев лежала в пределах 5-10% (табл. 4

Поскольку величина диапазонов допустимых значений в определенной степени связана с достигнутым уровнем качества методов исследования, доля неудовлетворительных результатов позволяет сравнивать соответствие им различных методик на разных контрольных образцах только в пределах одной аналитической характеристики. Если доля неудовлетворительных результатов при оценке повторяемости, например, превышает таковую при оценке правильности, это не означает, что смещение оказывает меньшее влияние на общую погрешность результата, чем случайная ошибка методики. Для сравнения влияния факторов внутридневной, междневной, межлабораторной и межнаборной вариации на дисперсию конечного результата необходимо иметь план межлабораторного эксперимента, соответствующий вышеописанной линейной модели дисперсионного анализа.

В 2011 г. во всех трех циклах раздела "Коагулология" была использована схема с двумя одинаковыми контрольными образцами, причем уровни определяемых показателей варьировались в разных циклах от нормальных к патологическим. Образцы цикла 2-11 были условно "нормальными", цикла 1-11 - "пограничными", а цикла 3-11 - "патологическими". Антитромбин в 2011 г. не был включен в раздел "Коагулология". Методом дисперсионного анализа были получены оценки коэффициентов вариации, характеризующих 4 фактора в иерархической модели, и их процентные доли в общей неопределенности результата (табл. 5

В случае определения протромбинового времени в секундах в нормальном образце 2/3 всей погрешности измерения приходится на различия между наборами реагентов от разных производителей. После преобразования к МНО или проценту протромбина по Квику доля фактора различий между наборами реагентов не превышает 25% от общей погрешности результата. На первый план выходит межлабораторная вариация, вклад которой в общую погрешность составляет 60-75%. Вклад междневной вариабельности при определении МНО составляет от 9 до 18%, а внутридневной (случайная ошибка прибора) - от 2 до 4%. Таким образом, наиболее важным источником аналитических погрешностей является калибровка прибора в лаборатории и/или однородность партии реагентов/калибраторов от одного производителя, в том числе вследствие различий в условиях их доставки и хранения.

При определении АЧТВ наблюдается увеличение коэффициентов вариации, характеризующих все виды источников погрешностей, по мере перехода от нормальных образцов к патологическим, а также увеличение доли фактора метода/набора реагентов в общей погрешности, которая достигает 50% на патологическом образце. Разброс средних значений, полученных на разных наборах реагентов, невелик в цикле 2-11 на нормальном контрольном образце, но становится весьма значительным в цикле 3-11 на патологическом образце, где крайние значения отличаются более чем в 2 раза (табл. 6

При определении тромбинового времени результат измерения в основном зависит от используемого набора реагентов - вклад этого фактора в квадратичную сумму превышает 50% на всех

образцах. Это объясняется тем, что различные наборы реагентов содержат тромбин в различных концентрациях: обычно 3, 6 или 9 ед/мл. И чем выше концентрация тромбина, тем меньше тромбиновое время, измеренное с помощью этого набора (табл. 7

Наборы реагентов от разных производителей для определения фибриногена хорошо стандартизованы между собой: коэффициент межнаборной вариации не превышает 10% и дает примерно такой же вклад в общую погрешность, как и междневная вариация. Основной вклад (порядка 75% и более) в дисперсию результатов вносит межлабораторная составляющая.

1. Основным источником аналитических погрешностей при определении показателей системы гемостаза является межлабораторная составляющая, которая заведомо превосходит внутридневную и междневную погрешности методик - ошибки, связанные с нестабильностью аналитической системы в рамках одного прибора.

2. Межлабораторная вариабельность на патологических образцах выше, чем на нормальных.

3. Для АЧТВ и тромбинового времени первостепенное значение приобретает различие между наборами реагентов разных производителей вследствие отсутствия их стандартизации.

Статья подготовлена при финансовой поддержке АСНП "ЦВКК".