Рак молочной железы (РМЖ) является самым частым онкологическим заболеванием, диагностируемым среди женщин. Рак яичника (РЯ) является основной причиной смертельных исходов в онкогинекологии вследствие бессимптомного течения заболевания на ранних стадиях, в результате чего до 80% случаев РЯ обнаруживается на III-IV стадии болезни, когда эффективность лечения крайне низка. Поэтому решающее значение приобретает возможность ранней диагностики рака данных локализаций на начальных этапах развития заболевания. Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 являются причиной приблизительно 30-40% семейных случаев РМЖ и более 90% семейных случаев РЯ. Рассматривая общую структуру заболевания, обнаруживают, что 3-8% всех случаев РМЖ и 20% случаев РЯ развиваются благодаря наследуемым аномалиям в указанных генах.

Одним из эффективных подходов, способствующих раннему выявлению РМЖ и РЯ, является молекулярно-генетическое определение их наследственных форм, которые преимущественно связывают с наследуемыми мутациями в генах-супрессорах опухоли BRCA1 (breast cancer 1) и BRCA2 (breast cancer 2). Важная функциональная особенность этих генов заключается в участии их белковых продуктов в поддержании целостности и стабильности молекулы ДНК. Утрата их функциональной активности влечет за собой накопление повреждений ДНК, что влечет за собой нарушение регуляции клеточного цикла, дифференцировки клетки, запрограммированной клеточной гибели - апоптоза, развитие генетической нестабильности, что является ключевым событием в процессе канцерогенеза. Протективная и противоопухолевая активность белков BRCA1 и BRCA2 может быть резко снижена или полностью утрачена вследствие наличия мутации (изменения) в нуклеотидной последовательности кодирующих их генов, что делает клетку чувствительной к воздействию внешнесредовых канцерогенных факторов, способных запускать процесс малигнизации. Если мутация первоначально возникла на уровне соматической клетки, то говорят о спорадической форме рака. При локализации передающейся из поколения в поколение мутации в половой хромосоме (герминальная мутация) - о наследственной форме рака. Молекулярно-генетическое исследование, позволяющее подтвердить наличие наследственной предрасположенности к раку, обусловленное герминальными мутациями, позволяет формировать группы повышенного риска развития РМЖ и РЯ для патогенетически обоснованной профилактики и/или ранней диагностики рака на начальных этапах развития, что позволяет существенно снизить заболеваемость и улучшить результаты своевременно проведенного лечения.

В табл. 1 приведена оценка риска развития рака при наличии наследуемой мутации в одном из исследуемых генов [1].

Молекулярно-генетическое исследование наследственной предрасположенности к РМЖ и/или РЯ как важный этап, уточняющий риск развития опухоли показано тем женщинам, для которых соблюдается одно из следующих условий:

- отягощенный семейный анамнез, включающий наличие двух родственниц или более первой степени родства с диагнозом РМЖ и/или РЯ;

- наличие в семье одного пораженного или более первично-множественными опухолями, включая двустороннее поражение парных органов;

- наличие в семье женщин, заболевших РМЖ и/или РЯ в возрасте до 42 лет;

- носительство известной мутации в генах BRCA1, BRCA2.

При обнаружении герминальной мутации женщину относят к группе риска, что позволяет проводить клинический мониторинг для выявления прогнозируемых форм рака на ранних стадиях развития, доброкачественных и предраковых состояний, фоновых патологий (дисгормональных и воспалительных заболеваний). Скринингу должны подвергаться все пациенты, относящиеся к группе риска, начиная с возраста 25 лет, либо на 10 лет ранее того возраста, в котором развилась опухоль у самой молодой родственницы первой степени родства. На этапе скрининга следует использовать весь арсенал современных диагностических мероприятий, в частности:

1. Лабораторные и инструментальные методы выявления опухолевой и предопухолевой патологии женской репродуктивной системы.

2. Рекомендации по реализации репродуктивной функции.

3. Коррекцию гормональных нарушений.

4. Соблюдение диеты, способствующей уменьшению риска. Американским раковым обществом были предложены 6 основных принципов питания, соблюдение которых дает реальный противораковый эффект:

- уменьшение потребления высококалорийной пищи;

- уменьшение потребления жира;

- включение в ежедневный пищевой рацион различных овощей и фруктов;

- потребление пищи, обогащенной клетчаткой;

- ограничение потребления алкогольных напитков;

- ограничение потребления копченой и нитритсодержащей пищи.

Отдельные популяции обнаруживают различную частоту патологических мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. В России: в результате независимых исследований установлен узкий спектр мутаций, включающий 5382insC, C61G, 185delAG, 4154delA, 2080delA в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2. Исследование указанных локусов позволяет охватить до 90% патогенетических мутаций, характерных для российской выборки [2]. При отсутствии распространенных мутаций и наличии явно выраженной отягощенной семейной истории РМЖ/РЯ рекомендуется полное секвенирование генов.

Наличие или отсутствие гетерозиготного носительства мутации 5382insC, C61G, 185delAG, 4154delA, 2080delA в гене BRCA1; 6174delT в гене BRCA2.

Венозная кровь.

Оптимальным методом исследования генетических полиморфизмов в рутинной лабораторной практике является один из методов секвенирования - пиросеквенирование. Для детекции однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) специально разработана система генетического анализа PyroMark Q24, основанная на методе пиросеквенирования.

Метод пиросеквенирования, также обозначаемый как пиросеквенирующий синтез или секвенирование путем синтеза, разработан Полом Нироном (Pål Nyrén) в Королевском техническом институте (Стокгольм, Швеция) в 1996 г. Метод основан на детекции высвобождающегося при синтезе ДНК пирофосфата. В результате ферментативного превращения пирофосфата регистрируется хемилюминесцентный сигнал. Высвобождение пирофосфата осуществляется после встраивания соответствующего нуклеотида во вновь синтезируемую цепь ДНК на матрице комплементарной цепи.

Определение нуклеотидной последовательности анализируемого генетического локуса с помощью систем генетического анализа PyroMark состоит из этапов:

Первым этапом анализа является наработка ампликона, содержащего полиморфный генетический локус. Этап включает в себя выделение ДНК из клинического материала и постановку ПЦР. Для выделения ДНК могут быть использованы комплекты реагентов РИБО-преп или ДНК-сорб-B производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. При амплификации фрагмента ДНК один из пары праймеров должен быть связан на 5'-конце с биотином; цепь ДНК, которая послужит матрицей для пиросеквенирования, амплифицируется с биотинилированным праймером.

В зависимости от направления секвенирования возможны два типа анализа: прямой анализ (forward analysis) и обратный анализ (reverse analysis). В первом случае с биотином связан обратный праймер для амплификации, во втором - прямой праймер для амплификации. После амплификации проводится пробоподготовка ампликона. ПЦР фрагмент инкубируется с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином. При помощи полуавтоматической вакуумно-фильтрационной станции (Vacuum Prep Workstation) проводится щелочная денатурация ампликона и серия отмывок, в результате которых образуется одноцепочечный ПЦР-продукт, который иммобилизируется на твердую поверхность (планшет для секвенирования) и используется как матрица в реакции пиросеквенирующего синтеза. При проведении очистки и щелочной денатурации ПЦР-продукта может быть использован набор для пробоподготовки ПИРО-преп производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. К одноцепочечному ПЦР-продукту добавляется секвенирующий праймер, который отжигается в области анализируемого генетического локуса, образуя дуплекс ДНК-матрица/секвенирующий праймер, необходимый для проведения реакции пиросеквенирующего синтеза. Весь этап пробоподготовки ПЦР-продукта занимает примерно 30 мин. Заключительным этапом анализа является секвенирование ПЦР-продукта - проведение реакции пиросеквенирующего синтеза и анализ полученных результатов. Детекция результатов пиросеквенирующего синтеза проводится автоматически в режиме реального времени с помощью пиросеквенаторов серии PyroMark с использованием наборов реагентов «BRCA-скрин» - профиль «Рак молочной железы и/или яичников» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Пример исследования пациента на наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников представлен в табл. 2.