Введение

Интерес к плазменным технологиям и аппаратам, генерирующим плазму, постоянно увеличивается. В ряде фундаментальных исследований показано противозудное, бактерицидное, противовоспалительное, тканестимулирующее, улучшающее микроциркуляцию и проапоптотическое действие плазмы [1, 2], эффективность при стерилизации живых и неживых поверхностей [3, 4], сокращение сроков заживления ран при лечении некоторых форм рака [5—8] с оптимальной переносимостью и биосовместимостью [9—11].

Применение технологий плазмы в дерматовенерологии и косметологии находится на этапе формирования протоколов работы. Поэтому необходимо оценить повреждающие факторы плазменного факела и отдаленные результаты воздействия на ткань.

В электрохирургическом высокочастотном аппарате ЭХВЧ-35-МЕДСИ «PLASMA RFL» (ООО «Медицинские Системы», Россия) генерируется плазма с температурой воздействия на ткань от десятков градусов до 120°C и выше в зависимости от установленных значений (мощность, длительность, частота, работа по влажной или по сухой поверхности кожи). Воздействие на эпидермис изменяется от незначительных субъективных ощущений (легкое точечное тепло или покалывание без визуальных повреждений) до формирования коагуляционных пленок диаметром до 1—2 мм с последующим переходом в корку и естественным отшелушиванием последней в течение 3—14 дней. Аппарат работает в 5 режимах: радиоволновое резание и коагуляция (2,64 МГц), спрей-коагуляция, радиоволновой лифтинг и режим плазменного термолиза. Наиболее интересным является режим работы «плазма RFL» (плазменный термолиз).

Цель исследования — изучить характер воздействия на кожу фракционного плазменного термолиза в режиме «плазменная стимуляция» путем оценки морфологических изменений эпидермиса и дермы лабораторных животных.

Материал и методы

Экспериментальный раздел исследования проведен на лабораторных крысах линии Wistar: это 1 молодое животное (в возрасте 1 мес) и 2 взрослые крысы (в возрасте 1 года). С помощью аппарата ЭХВЧ-35-МЕДСИ «PLASMA RFL» в режиме работы «плазма RFL» стандартной техникой (сканирование/сетка) наносили повреждения на эпидермис животных в проекции кожи (спина и живот). Шерсть в области воздействия сбривали с соблюдением правил асептики и антисептики. Использовали различные параметры частоты, мощности, длительности по увлажненной или сухой поверхности кожи: от 2 до 4 проходов в виде «сетки» — режим воздействия «плазменная стимуляция».

Материал для гистологических срезов получали из центральных областей. Использовали два метода окраски: гематоксилином и эозином для описания общего состояния кожи и оценки повреждений эпидермиса и пикро-Маллори для оценки состояния коллагеновых волокон и отека дермы.

На первом этапе на коже молодой крысы обработали 4 зоны на параметрах, применяемых в дерматовенерологии и косметологии. Использовали следующие настройки (частота — мощность — длительность, аппарат ЭХВЧ-35-МЕДСИ «PLASMA RFL»): 1) на сухую кожу — 10—20—22, 2 «сетки» («с»); 2) на влажную кожу — 10—20—22, 2 «с»; 3) на влажную кожу — 10—20—22, 4 «с»; 4) на влажную кожу — 10—12—14, 2 «с». Исследовано 4 образца кожи крысы, полученные через 30 мин после воздействия.

На втором этапе на 2 взрослых крысах обработали по 6 зон на увлажненной коже (рис. 1). Параметры идентичны для обеих крыс: 1) 10—22—24, 2 «с»; 2) 10—22—24, 4 «с»; 3) 10—20—22, 2 «с»; 4) 10—20—22, 4 «с», 5) 10—12—14, 2 «с»; 6) 10—12—14, 4 «с».

Рис. 1. Фотографии крыс с обозначенными маркером зонами сразу после воздействия плазмой (ЭХВЧ «PLASMA RFL»).

а — крыса №1; б — крыса №2.

Для объективизации критериев проведена гистологическая оценка образцов кожи крысы в норме.

При проведении исследования неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принята в Страсбурге 18.03.1986 и подтверждена в Страсбурге 15.06.2006).

Результаты

В коже интактной молодой крысы эпидермис представлен базальным слоем мелких эпителиоцитов, 2—3 рядами шиповатых эпителиоцитов, зернистыми клетками и роговыми эпителиоцитами. Толщина клеточного слоя эпидермиса (до рогового слоя) составляет 38—48 мкм. Под эпидермисом — сосочковый слой дермы (рыхло расположенные тонкие пучки коллагеновых волокон) до глубины 38—78 мкм. Глубже находятся более толстые пучки волокон, составляющие сетчатый слой дермы, диаметром 5—7 мкм. Между волокнами располагаются клетки фибробластического ряда и мононуклеарные лейкоциты (моноциты и лимфоциты) (рис. 2). В субэпидермальном слое выражена капиллярная сеть.

Рис. 2. Гистологическая картина биопсийного материала кожи молодой крысы в норме.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — окраска пикро-Маллори.

В коже взрослой крысы толщина эпидермиса сократилась до 21—30 мкм из-за уменьшения слоев клеток в шиповатом слое и уплощения зернистого слоя. Сосочковый слой дермы сократился до 25—35 мкм в глубину, волокна расположены более плотно, ориентированы вдоль поверхности кожи. Диаметр утолщенных пучков коллагеновых волокон сетчатого слоя дермы 10—12 мкм, пучки располагаются более рыхло, чем у молодой крысы. Количество клеток дермы (в том числе фибробластов) сокращено (рис. 3).

Рис. 3. Гистологическая картина биопсийного материала кожи взрослой крысы.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — окраска пикро-Маллори.

Результаты 1-го этапа эксперимента — сравнительная гистологическая оценка образцов кожи крысы через 30 мин после воздействия плазмой в режиме «плазменная стимуляция» при различных параметрах

Гистологическая оценка образцов представлена в таблице (жирным шрифтом обозначены самые сильные повреждения — некроз эпидермиса и коагуляция коллагеновых волокон дермы). Условные цифровые обозначения гистологических изменений эпидермиса: физиологическая норма — 0, отслоение рогового слоя — 1, перинуклеарный отек, чаще с утолщением эпидермиса до 45—50 мкм — 2, баллонная дистрофия — 3, истончение эпидермиса из-за уплощения клеток шиповатого слоя до 20—30 мкм — 4, истончение эпидермиса из-за уплощения клеток всех слоев в косо продольном направлении до 17—20 мкм — 5, некроз — 6; изменения дермы: физиологическая норма — 0, умеренный отек — 1, выраженный отек — 2, коагуляция до 100 мкм вглубь ткани от базальной мембраны эпидермиса — 3, коагуляция свыше 100 мкм вглубь ткани от базальной мембраны эпидермиса — 4.

Морфологические изменения эпидермиса и дермы после плазменного термолиза в различных режимах

Параметры 10—20—22 на сухую кожу и 10—12—14 на влажную кожу (по 2 прохода — «сетки») приводили к сопоставимым изменениям в эпидермисе и дерме. На параметрах 10—20—22 коагуляция наблюдали до глубины 380 мкм, а на параметрах 10—12—14 — до глубины 910 мкм. Соответственно, воздействие на влажную поверхность кожи при меньших параметрах давало более глубокий прогрев и более выраженные повреждения в дерме, что необходимо для ряда лечебных и косметологических процедур.

При параметрах 10—20—22 на влажную кожу эффект воздействия зависел от количества «сеток»: при нанесении 2 «сеток» в эпидермисе наблюдали отслоение рогового слоя, истончение клеток более глубоких слоев, умеренный отек дермы, при нанесении 4 «сеток» — перинуклеарный отек, единичные фокусы некроза, в дерме — более выраженный отек, единичные участки коагуляции коллагеновых волокон на глубину от 20 до 200 мкм.

Результаты 2-го этапа эксперимента — сравнительная гистологическая оценка образцов кожи крыс на 30-е и 60-е сутки после воздействия плазмой в режиме «плазменная стимуляция» при различных параметрах

Режим воздействия «плазменная стимуляция» 10—22—24

На 30-е сутки после нанесения 2 «сеток» эпидермис в области воздействия имеет неравномерную толщину от 11 до 32 мкм, при этом изменяется количество рядов клеток шиповатого слоя (рис. 4, а, б). Строение дермы сопоставимо с возрастной нормой, но при этом отмечены крупные очаги новообразованных коллагеновых волокон, достигающих глубины 150 мкм, располагающихся плотно и ориентированных в различных направлениях; количество клеток не изменяется (см. рис. 4, в, г).

Рис. 4. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10—22—24, 2 «сетки».

Здесь и на рис. 5—9: а, б — 30-е сутки, окраска гематоксилином и эозином; в, г — 30-е сутки, окраска пикро-Маллори; д — 60-е сутки, окраска гематоксилином и эозином; е — 60-е сутки, окраска пикро-Маллори.

На 60-е сутки после нанесения 2 «сеток» толщина эпидермиса становится более равномерной и составляет 25—32 мкм (см. рис. 4, д). Толщина сосочкового слоя дермы составляет 50—60 мкм, что превышает данный показатель в норме. Коллагеновые волокна сетчатого слоя дермы имеют меньший диаметр и располагаются более рыхло (см. рис. 4, е).

Нанесение 4 «сеток» на 30-е сутки приводит к утолщению эпидермиса в большей степени, чем нанесение 2 «сеток». Толщина эпидермиса варьирует от 25 до 42 мкм, местами достигая показателя кожи молодой крысы в норме (рис. 5, а, б). В дерме выявляются очаги новообразованных тонких, располагающихся рыхло, ориентированных параллельно поверхности кожи коллагеновых волокон, достигающих глубины 160 мкм (см. рис. 5, в). В других участках структура дермы не отличается от нормы (см. рис. 5, г).

Рис. 5. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10—22—24, 4 «сетки».

На 60-е сутки после нанесения 4 «сеток» на участке воздействия толщина эпидермиса равномерная, составляет 20—26 мкм, толщина сосочкового слоя находится в пределах 20—25 мкм, что соответствует норме (см. рис. 5, д, е). Толщина коллагеновых волокон дермы и плотность их расположения также не отличаются от нормальных показателей.

Режим воздействия «плазменная стимуляция» 10—20—22

На 30-е сутки после нанесения 2 «сеток» толщина эпидермиса в области воздействия составляет 26—46 мкм и местами достигает толщины эпидермиса молодой крысы в норме. В участке утолщения эпидермиса зернистый слой истончен, в 20% клеток шиповатого слоя необратимые дегенеративные изменения (кариопикноз). Толщина сосочкового слоя дермы также близка к показателям молодой крысы (37—43 мкм), однако встречаются участки с повышенной клеточной плотностью в данном слое (рис. 6, а, б). При этом увеличивается количество как фибробластов, так и мононуклеарных лейкоцитов. Очаги новообразованных коллагеновых волокон достигают глубины 180 мкм, содержат тонкие волокна, расположенные вдоль поверхности кожи. В сетчатом слое дермы коллагеновые волокна по сравнению с интактной кожей взрослой крысы тоньше и располагаются более рыхло (см. рис. 6, в, г). Возможно, часть повреждений в этом срезе получена механическим путем (более поздние).

Рис. 6. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10 — 20 — 22, 2 «сетки».

К 60-м суткам структура кожи идентична коже взрослой крысы без воздействия (см. рис. 6, д, е).

На 30-е сутки после нанесения 4 «сеток» наблюдается истончение эпидермиса до 14—23 мкм (рис. 7, а, б). Толщина сосочкового слоя дермы составляет 50 мкм. Очаги новообразованных коллагеновых волокон распространяются на глубину до 180 мкм. Толщина коллагеновых волокон сетчатого слоя дермы меньше, чем у взрослой крысы в норме, волокна располагаются более рыхло (см. рис. 7, в, г).

Рис. 7. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10—20—22, 4 «сетки».

На 60-е сутки толщина эпидермиса (27—37 мкм) и толщина сосочкового слоя дермы (25—37 мкм) не отличаются от этих показателей кожи взрослой крысы в норме (см. рис. 7, д). Коллагеновые волокна сетчатого слоя дермы не отличаются от нормы, однако располагаются более плотно (см. рис. 7, е).

Режим воздействия «плазменная стимуляция» 10—12—14

На 30-е сутки после нанесения 2 «сеток» эпидермис имеет неоднородную толщину (20—40 мкм). Толщина сосочкового — 30—43 мкм (рис. 8, а, б). Очаги новообразованных коллагеновых волокон глубиной 140 мкм, содержат тонкие волокна, расположенные неупорядоченно. В сетчатом слое дермы коллагеновые волокна тоньше и располагаются более рыхло по сравнению с интактной кожей взрослой крысы (см. рис. 8, в, г).

Рис. 8. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10—12—14, 2 «сетки».

К 60-м суткам после нанесения 2 «сеток» толщина эпидермиса составляет 25—38 мкм (см. рис. 8, д). Толщина сосочкового слоя дермы составляет 24—28 мкм, плотность расположения коллагеновых волокон и клеточный состав не отличаются от этих параметров кожи в норме (см. рис. 8, е).

На 30-е сутки после нанесения 4 «сеток» толщина эпидермиса составляет 24—42 мкм (рис. 9, а, б). Толщина сосочкового слоя дермы — от 24 до 40 мкм. Очаги новообразованных коллагеновых волокон распространяются на глубину до 110 мкм. Коллагеновые волокна сетчатого слоя дермы тоньше и располагаются более рыхло по сравнению с интактной кожей взрослой крысы (см. рис. 9, в, г).

Рис. 9. Гистологическая картина биопсийного материала кожи крысы после воздействия плазмой в режиме «стимуляция» 10—12—14, 4 «сетки».

На 60-е сутки после нанесения 4 «сеток» толщина эпидермиса составляет 50 мкм, его структура близка к структуре эпидермиса молодой крысы (см. рис. 9, д). Толщина сосочкового слоя — 53–80 мкм, что также близко к показателям кожи молодой крысы. Организация сетчатого слоя дермы (толщина и плотность расположения коллагеновых волокон, клеточная плотность и клеточный состав) сопоставима с таковой у взрослой крысы в норме (см. рис. 9, е).

Обсуждение

Воздействие фракционного плазменного термолиза (аппарат ЭХВЧ-35-МЕДСИ «PLASMA RFL») на кожу взрослых крыс увеличивает пролиферативную активность клеток эпителия и образование новых коллагеновых волокон в дерме. В режиме «плазменная стимуляция» происходит повреждение эпидермиса без существенной коагуляции в дерме. Разнонаправленность повреждений и их появление в дерме связаны с ручной техникой исполнения процедур, что говорит о необходимости «постановки руки» при работе с аппаратами плазмы, стандартизации техники проходов, строгого подсчета количества повторных нанесений.

Результаты воздействия зависят от количества наносимых «сеток». Минимальное количество проходов — 2, максимальное — 4 с учетом принципа селективной нагрузки областей воздействия.

Работа с меньшими параметрами мощности и длительности по влажной поверхности дает более глубокие термические повреждения в дерме, позволяет минимизировать повреждение эпидермиса и получить более качественные изменения в отдаленной перспективе. Анализ полученных данных и знания о физиологических реакциях кожи показал варианты применения плазмы для улучшения рельефа кожи, коагуляции доброкачественных образований кожи эпителиального происхождения, удаления рубцов, улучшения тургора, лифтинга кожи или лечения акне, розацеа, онихомикоза, но эти вопросы требует дальнейшего изучения.

Заключение

В ходе данного исследования подтверждено предположение о видах повреждений кожи, получаемых с помощью плазмы, мы также поняли четкую взаимосвязь техники нанесения и количества проходов, то есть качество выполнения техник влияет на результаты процедур. С учетом того, что при воздействии плазмы возможно аккумулировать тепло в глубоких слоях дермы, данные техники и методы могут применяться с целью лечения воспалительных процессов кожи (акне, розацеа и т.п.), при комбинированных протоколах лечения онихомикозов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.С. Чекмарев, Е.В. Липова

Сбор и обработка материала: А.С. Чекмарев, И.И. Глазко, Ю.Г. Витвицкая

Написание текста: А.С. Чекмарев, М.Р. Рахматулина

Редактирование: М.Р. Рахматулина, Е.В. Липова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: A.S. Chekmarev, E.V. Lipova

Collecting and interpreting the data: A.S. Chekmarev, I.I. Glazko, Yu.G. Vitvitckaya

Drafting the manuscript: A.S. Chekmarev, M.R. Rakhmatulina

Revising the manuscript: M.R. Rakhmatulina, E.V. Lipova