Влияние химических пилингов с ретиноидами на иммуногистохимические параметры кожи

Число людей пожилого возраста непрерывно увеличивается, поэтому волнующей для косметологов стала тема профилактики и коррекции внешних признаков старения, особенно на открытых участках кожного покрова. Открытые участки кожи со временем подвержены влиянию не только эндогенных, но и внешних/экзогенных факторов, которые ускоряют процессы старения, обусловливают появление гиперкератоза, телеангиэктазий, нарушения пигментации, создают условия для развития новообразований. Такой патологический процесс называется фотостарением [1, 2].

Для профилактики фотостарения даны общие рекомендации: защита от солнечных лучей, регулярное использование увлажняющих кожу препаратов. При сформированной клинической картине фотостарения его можно лечить.

К началу 90-х годов способность ретиноидов восстанавливать нормальную структуру кожи, поврежденную УФ-излучением, была полностью подтверждена многочисленными контролируемыми клиническими испытаниями, проведенными двойным слепым методом, как в США, так и в Европе [3]. Сейчас ретиноиды остаются основным средством для лечения фотостарения.

Ретиноевые рецепторы находятся в ядре клетки и входят в суперсемейство гормончувствительных рецепторов; они относятся к факторам транскрипции, их активация регулирует дифференцировку и пролиферацию клеток за счет стимуляции (преимущественно) или подавления экспрессии соответствующих генов [4].

В непосредственный контакт с ретиноевыми рецепторами вступают только активные формы витамина А: трансретиноевая кислота и ее модификации, которые обладают высоким раздражающим потенциалом и провоцируют вынужденные быстрые и яркие ответные реакции клеток. Формы-предшественники в виде ретиноевых эфиров, ретинола и ретинальдегида с помощью ферментных систем превращаются в активные метаболиты в самой клетке, которая способна самостоятельно контролировать баланс ретиноидов, запасая формы-предшественники в виде ретиноевых эфиров и постепенно высвобождая их [5, 6].

Цель настоящего исследования — изучить влияние современных химических пилингов с ретиноидами на кожу с признаками фотостарения.

Материал и методы

Четырем пациентам в разных стационарах города за 14 и 7 дней до плановой абдоминопластики и иссечения рубцов на ограниченном участке кожи выполнили одну процедуру пилинга с 5% ретиноевой кислотой (Yellow Peel Facial, Mene&Moy System, США) и одну — 5% ретинолом (Reti Fusion Peel, ARKANA COSMETICS, Польша, сделано в Евросоюзе). Процедура пилинга заключалась в 3-кратном нанесении пилинга с ретиноевой кислотой с 30-минутным интервалом. После первых двух нанесений косметическое средство смывали и высушивали кожу, после последнего нанесения его оставляли на коже на 2 ч, а затем смывали. По такой же схеме применяли пилинг с ретинолом. Все пациенты подписали информированное согласие на процедуру.

Иммуногистохимические исследования образцов кожи выполняли на криостатных срезах [7]. Криостатные срезы толщиной 5 мкм фиксировали абсолютным ацетоном, высушивали и окрашивали антителами с целью выявления экспрессии маркеров пролиферации (Ki-67), антиапоптоза (Bcl-2), рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR) и коллагену IV типа (Col IV). В работе использовали следующие антитела: Anti-Ki-67 («Bio Genex», США), Anti-Bcl-2 («Dako», Дания), Anti-EGFR («Bio Genex», США), Anti-Сol-IV («Bio Genex», США). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием набора полимера Super Sensitive TM Polimer HRP IHC Detection Systems (BioGenex). Результат реакции проявляли хромогеном диаминобензидином (DAB), препараты докрашивали гематоксилином.

Готовые гистологические препараты фотографировали. По отдельности выполняли съемку эпидермиса и дермы.

Фотографии обрабатывали с применением программы «Морфология 5.0», где выделяли области скопления белка — иммуногистохимического маркера и в зависимости от характера маркера выполняли морфометрию. Для Ki-67 подсчитывали количество меченых клеток в поле зрения микроскопа, для Bcl-2, Col IV и EGFR — оптическую плотность. В качестве контроля использовали образцы интактной кожи (до лечения), показатели которой принимали за 100%.

cтатистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.1. Соответствие показателей ИГХ нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Для выявления различий между группами был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Внутригрупповые различия выявляли с использованием апостериорных критериев, в частности критерия Тьюки (Tukey HSD). Достоверность различий принимали при р≤0,05.

Результаты

Однофакторный анализ (ANOVA) сравнения групп показал, что пилинг с ретиноидами оказал влияние на следующие исследуемые маркеры эпидермального слоя кожи: Ki-67 — маркер пролиферации клеток (F=35,58; p≤0,001), Bcl-2 — антиапоптотический фактор (F=3,57; p≤0,01), Col IV-коллаген базальной мембраны (F=5,81; p≤0,001). Влияние на рецептор к эпидермальному фактору роста (EGFR) (F=1,87; p≥0,05) не отмечено (табл. 1).

Таблица 1. Изменчивость маркеров эпидермиса под влиянием пилингов с ретиноидами. Показатели однофакторного анализа ANOVA Примечание. Здесь и в табл. 2: SS — сумма квадратов отклонения от среднего, df — степени свободы, MS — средний квадрат, F — критерий Фишера, p — уровень значимости.

При анализе показателей в дерме обнаружено, что пилинги с ретиноидами оказали влияние только на Ki-67 (F=7,66; p≤0,001) и не отразились на таких маркерах, как Bcl-2 (F=2,03; p≥0,05) и EGFR (F=1,82; p≥0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Изменчивость маркеров дермы под влиянием манипуляций. Показатели однофакторного анализа ANOVA

После пилинга с ретиноевой кислотой (табл. 3;

Таблица 3. Динамика показателя Ki-67 в коже после пилингов с ретиноидами (единицы измерения — количество меченых ядер, Mean±SEM) Примечание. Здесь и в табл. 4—6: * — p≤0,05, ** — p≤0,01, различие достоверно по сравнению с группой контроля; ^ — p≤0,05, ^^ — p≤0,01, различие достоверно по сравнению с показателем после пилинга с ретиноевой кислотой.

рис. 1)

через 7 дней количество пролиферирующих клеток в эпидермисе увеличилось на 262% (р<0,01) и продолжало оставаться очень высоким (выше на 220%) через 14 дней (р<0,01). После пилинга с ретинолом через 7 дней отмечалось небольшое и незначимое повышение пролиферации (Ki-67), а через 14 дней показатель практически восстановился (p>0,05). При сравнении пилингов между собой следует отметить, что пилинг с ретиноевой кислотой через 7 и 14 дней обусловливает гораздо более высокий уровень клеточной пролиферации в эпидермисе по сравнению с пилингом с ретинолом (р<0,01).

По результатам влияния пилингов на кожу (см. табл. 2) можно сделать вывод об отсутствии существенного влияния ретиноевой кислоты и ретинола на пролиферацию клеток в дерме. При сравнении пилингов между собой обнаружено значимое снижение (р<0,01) клеточной пролиферации в дерме после пилинга с ретинолом на 7-й день по сравнению с пилингом с ретиноевой кислотой, которое сохраняло ту же тенденцию (p>0,05) на 14-й день (см. табл. 3; рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия маркера Ki-67 в дерме. а — через 7 дней после пилинга с ретиноевой кислотой; б — через 7 дней после пилинга с ретинолом; в — через 14 дней после пилинга с ретиноевой кислотой; г — через 14 дней после пилинга с ретинолом; д — интактная кожа/контроль. ×125.

При сравнении действия пилингов между собой выявлено значимое повышение величины Bcl-2 после пилинга с ретиноевой кислотой на 14-й день по сравнению с пилингом с ретинолом (табл. 4;

Таблица 4. Динамика показателя Bcl-2 в коже после пилингов с ретиноидами (Mean±SEM) Примечание. Здесь и в табл. 5, 6: в качестве единиц измерения указана OD — оптическая плотность (Mean±SEM).

рис. 3).

По содержанию маркера Bcl-2 в дерме различий с контролем и между пилингами не выявлено (см. табл. 4; рис. 4).

Рис. 4. Экспрессия маркера Bcl-2 в дерме. а — через 7 дней после пилинга с ретиноевой кислотой; б — через 7 дней после пилинга с ретинолом; в — через 14 дней после пилинга с ретиноевой кислотой; г — через 14 дней после пилинга с ретинолом; д — интактная кожа/контроль. ×125.

По маркеру EGFR значимых отличий не выявлено ни в одной из групп сравнения ни в эпидермисе, ни в дерме (табл. 5).

Таблица 5. Динамика показателя EGFR после пилингов с ретиноидами (Mean±SEM)

Коллаген IV типа располагается в базальной мембране. После пилинга с ретиноевой кислотой на 7-й день уровень Col IV в базальной мембране оказался на 11% (p<0,05) ниже, чем в контроле, на 14-й день показатель снижался на 19% (p<0,05). После пилинга с ретинолом показатель Col IV на 7-й и на 14-й дни соответствовал значению в контроле. При сравнении пилингов между собой на 14-й день выявлен более низкий (p<0,05) уровень Col IV после пилинга с ретиноевой кислотой (табл. 6).

Таблица 6. Динамика показателя Col IV в коже после пилингов с ретиноидами (Mean±SEM)

Обсуждение

По данным литературы [6, 8], активация ретиноевых рецепторов регулирует дифференцировку и пролиферацию клеток за счет стимуляции соответствующих генов, ответственных за поддержание барьерной функции и гиперпролиферации эпидермиса. При этом скорость дифференцировки кератиноцитов отстает от скорости пролиферации и миграции. Точные механизмы влияния ретиноидов на дерму пока неизвестны, отмечено, что при использовании топических средств на основе ретиноидов отмечаются стимуляция пролиферации фибробластов, активация синтеза коллагена и снижение активности ММП. При сравнительном анализе влияния ретинола и ретиноевой кислоты на структуру и свойства кожи выявлено, что оба ретиноида обусловливают увеличение экспрессии генов коллагена I и III типа и синтез соответствующих им проколлагеновых молекул, причем этот эффект более выражен при использовании ретиноевой кислоты [9].

В нашем исследовании проведен сравнительный анализ действия на кожу ретинола как средства, отражающего физиологические потребности клетки в формировании барьерных свойств кожи, и ретиноевой кислоты, вызывающей прямую стимуляцию чувствительных к ней генов.

После пилинга с ретинолом в эпидермисе через 7 дней возрастает число пролиферирующих клеток (Ki-67), которое восстанавливается через 14 дней, в дерме число этих клеток снижается через 7 и через 14 дней. После пилинга с ретиноевой кислотой через 7 дней число пролиферирующих клеток резко возрастает и остается высоким через 14 дней, в дерме через 7 дней их число повышается и восстанавливается через 14 дней. Полученные данные указывают на то, что ретиноевая кислота вызывает активную пролиферацию клеток эпидермиса, продолжающуюся более 14 дней.

После пилинга с ретинолом, судя по показателю антиапоптоза Bcl-2, клеточная дифференцировка в эпидермисе незначительно снижалась к 14-му дню, в эпидермисе и дерме. После пилинга с ретиноевой кислотой этот показатель имел тенденцию к повышению в эпидермисе через 14 дней и не изменялся в дерме. Оценивая полученные результаты, можно предполагать, что в течение 14 дней процессы пролиферации клеток преобладают над их дифференцировкой.

Анализируя динамику экспрессии показателя EGFR, можно обратить внимание на отсутствие значимых изменений после применения обоих пилингов.

После пилинга с ретинолом, судя по уровню экпрессии Col IV, состояние базальной мембраны не изменялось, после пилинга с ретиноевой кислотой значения снижались через 7 дней и еще больше через 14 дней, возможно, отражая интенсивность метаболических процессов.

Заключение

В иммуногистохимическом исследовании для оценки влияния пилингов с ретиноидами на кожу можно использовать в эпидермисе маркеры Ki-67, Bcl-2 и Col IV, в дерме — Ki-67.

Действие пилинга с ретинолом на кожу заключается в усилении клеточной пролиферации в эпидермисе в пределах 14 дней.

Действие пилинга с ретиноевой кислотой на кожу вызывает резкое повышение клеточной пролиферации в эпидермисе более 14 дней и отчасти в дерме с соответствующим снижением процессов дифференцировки и активацией процессов перестройки базальной мембраны. Действие пилинга с ретиноевой кислотой носит более выраженный по сравнению с ретинолом, характер, направленный на восстановление/обновление кожи.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Королькова

Сбор и обработка материала — И.А. Шепилова, Н.В. Калмыкова

Статистическая обработка данных — Н.В. Калмыкова

Написание текста — И.А. Шепилова, Т.Н. Королькова

Редактирование — Т.Н. Королькова, Н.В. Калмыкова

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Authorsâ€™ contributions:

The concept and design of the study - T.N. Korolkova

Collecting and interpreting the data — I.A. Shepilova, N.V. Kalmykova

Statistical analysis - N.V. Kalmykova

Drafting the manuscript - I.A. Shepilova, T.N. Korolkova

Revising the manuscript — T.N. Korolkova, N.V. Kalmykova

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Т.Н. Королькова — д.м.н., проф.; https://orcid.org/0000-0001-7190-411X

И.А. Шепилова — https://orcid.org/0000-0002-4147-9789

Н.В. Калмыкова — к.б.н.; https://orcid.org/0000-0003-4435-1884

Автор, ответственный за переписку: Королькова Татьяна Николаевна — ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия; e-mail: tnkor@mail.ru