Разработка набора реагентов для выявления антител класса G к отдельным антигенам цитомегаловируса методом иммунного блоттинга в формате Western Blot

Для современного здравоохранения лечение цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) становится все более актуальной проблемой: Европейским региональным бюро Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) она отнесена к группе заболеваний, которые определяют будущее инфекционной патологии. Цитомегаловирус (ЦМВ) - это не только один из этиологических факторов внутриутробных и перинатальных аномалий. Он также может вызывать тяжелые пневмонии в посттрансплантационном периоде, после ожоговых травм, у онкогематологических больных. ЦМВИ обусловливает 4-6% случаев посттрансфузионных гепатитов.

ЦМВИ подвержены все слои населения всех регионов земного шара, хотя у экономически и социально незащищенной части населения она встречается чаще, чем среди лиц среднего класса и у богатых. По данным ВОЗ, заболевания, вызванные группой герпес-вирусов, в которую входит и ЦМВ, как причина смертности от вирусных инфекций занимают второе место в мире (15,8%) после гриппа (35,8%).

ЦМВ в организме человека может находиться в латентном состоянии, в стадии активной репликации без развития органных поражений и быть причиной тяжелой клинически выраженной патологии, не имеющей очевидной связи с ЦМВИ. Именно поэтому все более актуальными становятся вопросы дифференциальной лабораторной диагностики ЦМВИ, направленной не только на подтверждение присутствия самого ЦМВ в организме пациента, но и определение стадии его активности [1].

Одним из наиболее эффективных инструментов диагностики инфекционной патологии при отсутствии специфических клинических проявлений служит определение класса и динамики видоспецифических антител (АТ) в крови пациента, поскольку наличие видоспецифических IgМ и/или нарастание титра специфических IgG является практически однозначным свидетельством активного течения первичной инфекции или реинфекции, или обострения хронического процесса [2]. Не является исключением и ЦМВИ, характеризующаяся крайней вариабельностью клинических проявлений, хотя отдельные исследователи полагают, что наличия в крови больного специфических IgM-антител и/или существенное увеличение титров специфических IgG-антител недостаточно для окончательной диагностики ЦМВИ, а достоверным критерием высокой активности ЦМВ, доказывающим его этиологическую роль в развитии тех или иных клинических синдромов, считают высокий титр ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови [3]. Однако, как правило, серологических маркеров активной ЦМВИ вполне достаточно для ее диагностики, тем более что их определение наиболее доступно для большинства клинико-диагностических лабораторий [4].

Алгоритм серологического исследования предусматривает выявление АТ к ЦМВ, определение их класса, определение авидности и титра IgG-антител и, при необходимости (при недостаточности полученной информации для постановки окончательного диагноза), проведение иммунного блоттинга (ИБ), т.е. выявление специфических АТ классов М и G к отдельным антигенам ЦМВ, позволяющее отслеживать динамику смены белков в ходе инфекционного процесса, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

ИБ - это, по сути, один из вариантов твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), при котором АТ, присутствующие в исследуемом образце, взаимодействуют с отдельными антигенами возбудителя, нанесенными на полоски нитроцеллюлозной мембраны (стрипы). Образующиеся при этом комплексы «антиген-АТ» связываются затем с конъюгатом - видоспецифическими антителами к Ig человека, меченными ферментом, и выявляются по цветной реакции с субстратом этого фермента в присутствии соответствующего индикатора. Интенсивность реакции определяется содержанием в образце соответствующих АТ. В зависимости от способа нанесения антигенов на нитроцеллюлозную мембрану различают ИБ в формате Western Blot (на мембрану методом электропереноса наносят белки лизата вирусной культуры, подвергнутой электрофорезу) или Line-blot (на определенные участки мембраны наносят в определенном порядке только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные); возможен также комбинированный формат ИБ («Western-Lineblot») [5, 6].

Антигены ЦМВ подразделяют на три категории:

1) перекрестно реагирующий антиген с молекулярной массой 65 кДа и неопределенные антигены;

2) низкоспецифичные антигены с молекулярной массой 75, 55, 52 и 38 кДа;

3) высокоспецифичные антигены с молекулярной массой 150, 130 и 28 кДа.

Наличие АТ хотя бы к одному из высокоспецифичных антигенов свидетельствует о формировании иммунного ответа к ЦМВ, т.е. о том, что у пациента идет активный инфекционный процесс. Соответственно, наличие АТ к антигену рр65 (предранний белок) может расцениваться как маркер первичной (острой) инфекции, реактивации процесса или суперинфекции. Не исключена его наработка при суперинфекции [5].

Опыт использования ИБ свидетельствует об эффективности его применения при диагностике как приобретенной, так и врожденной ЦМВИ, в том числе у лиц с выраженным иммунодефицитом (при ограничении синтеза АТ или при их поликлональной наработке). К достоинствам ИБ следует также отнести возможность автоматизации как постановки анализа, так и учета его результатов, в том числе с объективизацией оценки интенсивности реакции.

До настоящего времени для подтверждающих исследований на ЦМВИ могли быть использованы только тест-системы формата Western Blot зарубежных производителей, высокая стоимость которых существенно ограничивает возможности их широкого использования в практике отечественного здравоохранения. Именно поэтому разработка соответствующего отечественного продукта, по диагностической эффективности не уступающего своему зарубежному аналогу, но значительно более дешевому, достаточно актуальна.

Для приготовления иммуносорбента использовали нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Whatman» (Германия), для получения специфических антигенов ЦМВ - ультразвуковые лизаты культуры штамма AD-169 на диплоидных клетках фибробластов человека (линия М-22).

В качестве конъюгата применяли козьи АТ к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой фирмы «Jakson» (США).

Для индикации реакции использовали 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий («KEM-EN-TEC», Дания).

При разработке данной тест-системы использовали следующие методы:

1) электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (денатурирующие условия по Laemmli), приводящий к разделению по молекулярному весу смеси биологических макромолекул;

2) электроперенос разделенных белков из геля на твердую подложку (нитроцеллюлозную мембрану) - блоттинг;

3) выявление перенесенных на мембрану белков с помощью ИФА с последующей визуальной оценкой результатов исследования.

Создание новой тест-системы потребовало решения широкого круга вопросов:

- выбрать оптимальную концентрацию вирусного лизата;

- подобрать условия электрофореза и электрофоретического переноса белковых комплексов на нитроцеллюлозную мембрану;

- определить условия последующей обработки мембраны;

- выбрать конъюгат и окрашивающий раствор;

- оптимизировать состав буферных растворов для отмывки стрипов, разведений сывороток и конъюгата;

- определить оптимальные условия инкубации иммуносорбента с сыворотками и конъюгатом.

Первый и, пожалуй, самый важный этап в разработке данной тест-системы был связан с отработкой технологии изготовления иммуносорбента.

Поскольку определяющую роль в этом процессе играет качество его специфического компонента - антигена, основное внимание было уделено культивированиию ЦМВ и получению очищенного вирусного лизата. Были определены оптимальные условия культивирования ЦМВ, в частности, сроки, к которым вирус достигает максимальной цитопатической активности в ростовых клетках, режим обработки ультразвуком культуры зараженных клеток, условия очистки полученного лизата, составы вспомогательных растворов.

Анализ молекулярного состава лизата показал наличие в нем белков рp150, рp130, gр75, рр65, gр55, рp52, р38, рp28.

Для изготовления самого иммуносорбента были подобраны оптимальная концентрация ПААГ, выбран оптимальный метод его заливки - двухфазный гель (верхняя фаза - разделяющая, нижняя - концентрирующая), подобрана оптимальная загрузка лизата на поверхность геля, подобран и подготовлен агент для блокирования неспецифического связывания на полученных мембранах.

На втором этапе были определены оптимальный состав реагентов для проведения ИФА (раствор для разведения сывороток, промывочный раствор, конъюгат) и проведена собственно отработка схемы постановки ИФА. Было установлено оптимальное время инкубации стрипов с сывороткой, конъюгатом и окрашивающим раствором.

Итогом разработки явилась тест-система ИФА-Блот-ЦМВ- IgG следующего состава:

- иммуносорбент - полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны с сорбированными на них методом электропереноса индивидуальными белками (антигенами) ЦМВ: рp150, рp130, gр75, рр65, gр55, рp52, р38, рp28; в виде контрольной линии нанесены АТ к IgG человека - для контроля правильности проведения реакции (стрипы - в пластиковом контейнере с крышкой);

- конъюгат - козьи АТ к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой; непрозрачная пенящаяся жидкость светло-желтого цвета;

- окрашивающий раствор - 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитроголубой тетразолий; прозрачная светло-зеленого цвета жидкость;

- 5-кратный концентрат промывочного раствора [ПР(×5)] - непрозрачная пенящаяся жидкость светло-желтого цвета, возможно выпадение осадка, растворяющегося при встряхивании;

- раствор для разведения сывороток - непрозрачная пенящаяся жидкость светло-желтого цвета; возможно выпадение осадка, растворяющегося при встряхивании;

- референс-стрип (или его фотография) - стрип с проявленным белковым профилем антигена ЦМВ.

Диагностическая эффективность новой тест-системы была оценена вначале на сыворотках панели «Стандарт АТ-G (+/-) ЦМВ» ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск). Результаты этого исследования (табл. 1) указывают на полное совпадение оценок сывороток панели, полученных в исследовании, с их паспортными характеристиками.

Далее для оценки диагностической эффективности новой тест-системы исследовали 30 сывороток, полученных из коммерческой лаборатории «Инвитро» (Москва), предварительно оцененных в ИФА с помощью ИФТС ИФА-ЦМВ-IgG (ЗАО «ЭКОлаб») и в РИФ с помощью набора Цито­мегаловирус-IgG-РИФ («ViroImmun», Германия). Образцы с 1-го по 26-й в обеих указанных тест-системах (в ИФА и РИФ) показывали положительный результат, а образцы с 27-го по 30-й - отрицательный.

Результаты ИБ (табл. 2) подтвердили оценки иледованных образцов, полученные в ИФА и РИФ.

Для сравнения диагностической эффективности новой тест-системы с аналогичным импортным набором 15 образцов были исследованы в ней и в тест-системе anti-CMV (IgG) Western Blot («Euroimmun AG», Германия). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Как следует из табл. 3, в проведенных испытаниях получено полное совпадение итоговых оценок исследованных образцов и практически полное совпадение оценок наличия АТ почти ко всем отдельным антигенам ЦМВ, в том числе и по антигену gр75, учет наличия АТ, к которому не предусмотрен инструкцией по применению набора фирмы «Euroimmun» (коэффициенты корреляции полученных оценок составили 0,94-1,00). Несколько меньшим (но также достаточно высоким (с коэффициентом корреляции, равным 0,66) было соответствие оценок наличия АТ к антигену рр150, которые также не учитываются при использовании набора сравнения.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что новая тест-система для проведения подтверждающих исследований на ЦМВИ методом ИБ имеет высокую диагностическую эффективность, не уступающую использованному импортному аналогу. Более того, с учетом данных последних лет, согласно которым антигены рр150 и gр75 играют не последнюю роль в процессе взаимодействия ЦМВ с организмом хозяина, выявление АТ к ним, несомненно, повышает диагностическую эффективность исследования и может рассматриваться как очевидное преимущество новой тест-системы перед ее аналогом [7, 8].

Кроме более низкой стоимости новой тест-системы (стоимость набора anti-CMV (IgG) Western Blot - 440 евро, т.е. 18 000-19 000 руб.; себестоимость лабораторного образца набора ИФА-Блот-ЦМВ-IgG - 5000-10 000 руб.) отечественная тест-система превосходит свой импортный аналог и по ряду потребительских характеристик. Так, при ее использовании не требуется операция блокирования иммуносорбента, что сокращает длительность анализа на 15 мин, для исследования требуется в 1,5 раза меньший объем образца, нет необходимости его предварительно разводить и, наконец, стрипы иммуносорбента упакованы в стерильную пробирку, а не наклеены, как в аналоге, на картонную подложку, перед использованием от которой их необходимо отделять, сами стрипы в тест-системе ИФА-Блот-ЦМВ-IgG существенно длиннее, чем в наборе сравнения (10-12 см против 8,5 см), что, очевидно, облегчает оценку результатов ИБ.