Несмотря на снижение в последние годы доли сифилиса в структуре инфекций, передаваемых половым путем [1], он остается социально значимым заболеванием, требующим повышенного внимания специалистов в области здравоохранения.

Следует учитывать также, что одновременно со снижением заболеваемости манифестными формами сифилиса увеличилась доля его скрытых форм, как ранних, так и поздних, что характерно для периода угасания эпидемического процесса. В структуре поздних форм сифилиса повысился удельный вес нейросифилиса, причем увеличилась доля больных ранним и поздним нейросифилисом. Увеличилась доля скрытого сифилиса как раннего, так и позднего [2].

Основным инструментом лабораторной диагностики сифилиса являются серологические исследования, начинающиеся, как правило, со скрининга с использованием таких неспецифических (нетрепонемных) тестов, как реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном, и заканчивающиеся подтверждающими исследованиями с использованием таких специфических (трепонемных) тестов, как реакция иммунофлюоресценции (РИФ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющих определить наличие и содержание в крови пациента видоспецифических антител классов М, А и G. В последние годы в качестве подтверждающих методов исследования на сифилис все шире используют иммуноблоттинг (ИБ) — выявление и оценку содержания антител к отдельным антигенам Treponema pallidum, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране [3—6].

В настоящее время в России зарегистрированы две отечественные тест-системы для проведения указанных исследований — Трепонема-Блот (ЗАО БТК «Биосервис») и Лайн-Блот Cифилис-IgG (ЗАО «ЭКОлаб»), ориентированных на определение только IgG-антител.

В то же время в диагностике заболевания и определении его стадии особое значение имеет выявление антитрепонемных антител класса М. Наличие IgM-антител можно рассматривать как достоверный маркер активного инфекционного процесса. При этом следует учитывать, что указанные антитела выявляются в 100% случаев только при врожденном сифилисе, при первичном — приблизительно в 80% случаев, при вторичном — в 60%, при латентном — в 50%, при нейросифилисе — в 34% и при третичном — только в 11% случаев. При успешном лечении титр IgM-антител снижается до неопределяемых значений. Обнаружение IgM-антител к T. pallidum в крови новорожденного подтверждает диагноз «врожденный сифилис». Отсутствие IgM-антител у младенца, родившегося от больной сифилисом матери, не исключает наличия врожденного заболевания. Кроме того, отрицательный результат IgM-антителообразования может свидетельствовать об отсутствии болезни или ее слишком раннем сроке, когда не выработался иммунный ответ или о достаточно давнем (более 1 мес) инфицировании [3—5].

В связи с этим представляется актуальной разработка отечественной тест-системы для проведения ИБ для выявления IgM-антител к T. pallidum.

За основу разработки была взята тест-система Лайн-Блот Cифилис-IgG (Регистрационное удостоверение №ФСР 2010/06925 от 01.03.10), т.е. новая тест-система Лайн-Блот Cифилис-IgG представляет собой набор реагентов, рассчитанный на исследование 24 образцов сыворотки (плазмы) крови или ликвора человека на наличие и содержание IgM-антител к четырем антигенам T. pallidum — TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.

В новый набор входят:

— иммуносорбент — тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на каждую из которых в виде поперечных полос нанесены рекомбинантные аналоги указанных антигенов T. pallidum, а также пять контрольных линий (см. рисунок);

— 10-кратный концентрат промывочного раствора;

— раствор для разведения исследуемых образцов;

— субстратный раствор — раствор хромогенного субстрата для выявления ферментативной активности щелочной фосфатазы;

— референс-стрип — образец-шаблон со стрипом той же серии, что и иммуносорбент, проинкубированным с положительной, ранее охарактеризованной сывороткой, содержавшей IgМ-антитела;

— конъюгат — антитела козьи к IgМ человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой.

Кроме того, новый набор включает РФ-сорбент — антитела козьи к IgG человека, используемый для удаления IgМ-антител ревматоидного фактора, а также избытка IgG-антител.

Кроме линий (зон) рекомбинантных антигенов, на каждом стрипе имеются пять контрольных линий. Линия контроля антигена (К_АГ) — для оценки корректности проведения теста на данном образце (при правильно проведенном исследовании эта полоса не окрашивается). Три калибровочные линии, которые при проведении анализа дают зоны дискретно уменьшающейся интенсивности окрашивания, соответствующие баллам 3+, 1+, 0,5+. Линия контроля внесения образца — для самоконтроля (должна быть окрашена при правильном проведении исследования).

Процедура ИБ с использованием новой тест-системы отличается от процедуры ИБ с использованием оригинала только предварительной обработкой исследуемых образцов РФ-сорбентом (образец разводят 1:1 и после 30-минутной инкубации при комнатной температуре центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин, в дальнейшем исследовании используют супернатант).

Регистрация, учет и интерпретация результатов проводятся по тем же правилам, которые были разработаны для прототипа.

Тест-система прошла технические и медицинские испытания в Государственном научном центре дерматовенерологии и косметологии, где продемонстрировала 100% диагностическую чувствительность и специфичность.

Диагностическая эффективность тест-системы Лайн-Блот Cифилис-IgG была оценена на 126 образцах сывороток крови и 31 спинномозговой жидкости, полученных от пациентов, проходивших обследование на сифилис в Московской городской клинической больнице №14 им. В.Г. Короленко и в ГБУЗ «Центр планирования семьи и репродукции» Минздрава Краснодарского края (Краснодар).

В число обследуемых лиц вошли:

1) лица, имевшие половой контакт с лицом, имеющим установленный ранее диагноз сифилиса (17 человек);

2) лица с положительными нетрепонемными реакциями (10);

3) лица с положительным результатом на наличие IgM-антител в ИФА (9);

4) лица с подозрением на первичное заражение (14);

5) лица с подозрением на реинфекцию при вторичном сифилисе (17);

6) лица, проходящие плановое обследование, в том числе беременные (27);

7) лица с наличием клинических проявлений заболевания (10);

8) лица, имевшие половой контакт с лицом, имевшим установленный ранее диагноз «нейросифилис» (1);

9) лица с подозрением на ранний скрытый сифилис (17);

10) лица с подозрением на неуточненный скрытый сифилис (1);

11) лица с подозрением на ранний врожденный сифилис (3).

Образцы сывороток крови были предварительно аттестованы в ИФА с использованием иммуноферментных тест-систем для выявления IgM-антител к T. pallidum (ЗАО «ЭКОлаб», ЗАО «Вектор-Бест», ООО НПО «Диагностические системы», ЗАО «МБС»), а также в РИФ_абс с использованием «Антипаллидум-Флюороген-IgM/IgG» — диагностикума для выявления антител классов М и G к T. pallidum в РИФ (ЗАО «ЭКОлаб»). Образцы ликвора предварительно исследовали теми же методами с использованием тест-систем тех же производителей для выявления IgG- и IgM-антител.

Предварительная оценка на наличие IgM-антител к T. pallidum в 126 образцах сыворотки крови в ИФА и РИФ_абс дала 54 положительных, 50 отрицательных и 22 сомнительных результата. При этом ИБ в тест-системе Лайн-Блот Cифилис-IgG подтвердил 53 положительных, 48 отрицательных и 6 сомнительных результатов; 1 отрицательный и 12 сомнительных результатов были переквалифицированы в положительные, 3 сомнительных получили отрицательную оценку и по одному образцу, предварительно оцененному как положительный и отрицательный, были переквалифицированы в сомнительные.

Для 19 образцов, предварительные оценки которых не совпали с оценкой в ИБ с новой тест-системой, был дополнительно проведен ИБ с использованием тест-системы Treponema Pallidum-WESTERNBLOT («EuroImmun», Германия). Результаты сравнительного анализа ИБ этих образцов сыворотки крови в новой тест-системе и тест-системе Treponema Pallidum-WESTERNBLOT представлены в таблице.

Как следует из таблицы, получено практически полное совпадение оценок в обеих тест-системах (коэффициент корреляции ранговых оценок составил 0,93).

Предварительное исследование образцов ликвора в ИФА, РПГА и РИФ_абс дало во всех случаях отрицательный результат по наличию IgM-антител к T. pallidum. IgG-антитела обнаружены в 14 образцах, 12 образцов по наличию этих антител были оценены как отрицательные, 5 — как неопределенные.

ИБ всех образцов ликвора был выполнен с использованием как новой тест-системы, так и тест-системы-прототипа (Лайн-Блот Cифилис-IgG). Его результаты полностью совпали с данными предварительной оценки образцов.

Обоснованность включения в состав нового набора РФ-сорбента, т.е. целесообразность предварительной обработки им исследуемых образцов, показана при исследовании 23 образцов сыворотки, которые давали положительный результат при исследовании на РФ-фактор. ИБ этих образцов без предварительной обработки РФ-сорбентом дал 17 отрицательных и 6 сомнительных результатов, а ИБ после такой обработки — 21 отрицательный и 2 сомнительных результата соответственно, что позволяет говорить о существенном повышении диагностической специфичности набора.

Разработка технологий производства рекомбинантных антигенов Treponema pallidum способствовала широкому внедрению в серологическую диагностику сифилиса методов ИФА, в том числе ИБ в формате лайн-блоттинга, реализацией которого явилась разработка тест-системы Лайн-БлотCифилис-IgG.

Использование ИБ особенно важно при необходимости верифицировать диагноз в сложных случаях, в частности для серологической диагностики во второй половине инкубационного периода, диагностики скрытого врожденного сифилиса в первые дни жизни ребенка, выявления скрытого сифилиса у лиц со слабым гуморальным ответом, а также для дифференцирования ложноположительных и противоречивых результатов серореакций [7—10].

Поскольку в пуле исследованных образцов были представлены фактически все указанные случаи, результаты испытаний новой тест-системы Лайн-Блот Cифилис-IgG позволяют высоко оценивать ее диагностическую эффективность как подтверждающего теста в комплексной серологической диагностике сифилиса.