Trichomonas vaginalis, простейшее, вызывающее урогенитальный трихомониаз, — одна из наиболее распространенных инфекций, передающихся половым путем. Диагностика инфекции базируется на данных клинического и лабораторного обследования, при этом диагноз урогенитального трихомониаза считается установленным только при лабораторном подтверждении наличия возбудителя. Классическими или рутинными тестами, используемыми для обнаружения T. vaginalis, являются микроскопия и культуральный посев. Культуральное исследование рассматривается как «золотой стандарт» диагностики трихомониаза. Однако в последние годы все большую роль в диагностике инфекций играют методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), среди которых в нашей стране наиболее известны полимеразная цепная реакция (ПЦР) и реакция транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification — NASBA). Важнейшей характеристикой лабораторного метода является диагностическая чувствительность (ДЧ) — показатель, отражающий долю случаев выявленной инфекции среди обследованных инфицированных лиц. ДЧ в свою очередь в значительной степени определяется пределом обнаружения — минимальным количеством возбудителя, обнаруживаемым лабораторным тестом. Чем ниже предел обнаружения микроорганизма, тем выше его аналитическая чувствительность, и, как следствие, выше ДЧ. Для более полного и объективного представления о возможностях тех или иных лабораторных методов следует иметь их количественно охарактеризованные аналитические характеристики, в частности предел обнаружения.

Цель настоящего исследования — установить значения пределов обнаружения методов выявления T. vaginalis – микроскопии, культурального посева, ПЦР и НАСБА, используемых в лабораторной практике при диагностике мочеполового трихомониаза.

Культура клетокT. vaginalisи приготовление образцов для исследования. В работе использовали свежий изолят T. vaginalis, выделенный на среде Vagicult («Orion Corporation Orion Diagnostica», Финляндия) от пациентки с клиническими проявлениями урогенитальной инфекции. После получения чистой культуры T. vaginalis штамм поддерживался постоянными пассажами на питательной среде СВТ (ФГУН НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). Для эксперимента использовали культуру клеток, находящуюся в логарифмической фазе роста, и при микроскопическом исследовании которой в среде обнаруживались только подвижные клетки классической морфологии. Полученную клеточную массу ресуспензировали в подогретом до 37 °С физиологическом растворе, отбирали аликвоту и определяли концентрацию трихомонад методом прямого подсчета клеток в камере Горяева. Расчеты вели по формуле: C= a × 10 000, где С — число клеток в 1 мл суспензии, а — среднее число клеток в 25 больших квадратах сетки, 10 000 — множитель, приводящий результат к 1 мл [1]. Далее из полученной суспензии клеток готовили последовательные десятикратные разведения таким образом, чтобы расчетное количество простейших в последней пробирке было менее одной клетки на 1 мл физиологического раствора, а общий объем каждого разведения составлял 2 мл. Из каждого разведения отбирались аликвоты, объем которых зависел от протокола используемого метода, и проводилось их дальнейшее исследование.

В общем виде схема исследования аналогична использованной в нашей предыдущей работе (П.Г. Рыжих, 2011).

Исследования образцов с помощью микроскопии. Для микроскопического исследования отбирали аликвоты по 10 мкл и готовили: 1) три нативных препарата, которые исследовали в течение 2—3 мин с момента приготовления, подсчитывали среднее количество подвижных клеток в 10—100 полях зрения при увеличении 400 (×400); 2) три препарата, окрашенных по методу Романовского—Гимзы, которые исследовали в течение суток с момента приготовления, и подсчитывали среднее количество клеток трихомонад в 10—100 полях зрения (×1000).

Исследование образцов культуральным методом. Для культурального исследования использовали три бесклеточные питательные среды, применяемые в Российской Федерации: питательную среду СВТ, питательную среду для выделения трихомонад (ООО НПФ «Диагност-Мед», Омск) и основу агара «Трихомонас» («Himedia», Индия). Все среды готовили и использовали в соответствии с инструкцией производителей. Кроме того, в исследование была включена среда СВТ, в которой культивирование T. vaginalis проводилось в присутствии эукариотической клеточной линии L-41 (ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, Москва) с концентрацией 10⁵ клеток/мл (СВТ+L-41).

При проведении культурального исследования по 100 мкл аликвот из разведений суспензии трихомонад переносили в пробирки с 900 мкл соответствующей питательной среды. Для каждого варианта питательных сред готовили и исследовали по три образца из каждого разведения. Пробирки с питательными средами после внесения посевного материала сразу помещали в термостат для инкубации при 37±1 oC. Учет результатов проводили через 2, 4 и 7 сут. Наличие или отсутствие роста трихомонад определяли при микроскопии нативного материала из придонного слоя питательной среды. Учет результатов проводился на основании наличия подвижных клеток T. vaginalis при просмотре 10—20 полей зрения.

Исследование образцов методами амплификации нуклеиновых кислот. В работе использовали серийно выпускаемые и зарегистрированные в Российской Федерации наборы реагентов марки АмплиСенс (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) на основе методов ПЦР и НАСБА. ДНК выделяли с помощью набора реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ФСР №2007/00183), для ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов Амплисенс-Trichomonas vaginalis-FL (ФСР №012б2006/5190). Рибосомальную РНК T. vaginalis определяли с помощью набора реагентов АмплиСенсT.vaginalis-РИБОТЕСТ (ФСР №2010/07305). Амплификацию и детекцию проводили на приборе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия). Для ПЦР и НАСБА брали по 100 мкл клеточной суспензии из разведений культуры. Исследование проводили по инструкциям, прилагающимся к наборам реагентов.

В нашем исследовании мы впервые провели количественную оценку пределов обнаружения лабораторных тестов, используемых для выявления T. vaginalis на основе серийно выпускаемых и используемых в Российской Федерации наборов реагентов.

Для этого были приготовлены суспензия клеток трихомонад c известной исходной концентрацией (1,45±0,24)×10⁶ клеток/мл, и 10-кратные разведения, из которых отбирались аликвоты, объемом, соответствующим протоколу используемого метода. Пределом обнаружения считали минимальную концентрацию простейших, при которой они обнаруживаются при использовании определенного метода.

Результаты выявления T. vaginalis разными методами представлены в таблице.

Оценивая результаты двух методов микроскопии, следует отметить, что при высокой (более 10⁶ клеток/мл) концентрации клеток T. vaginalis в исходном образце в обоих случаях было выявлено достаточное содержание клеток в каждом поле зрения микроскопа и для интерпретации результатов достаточно было проанализировать не более 10 полей зрения.

При микроскопическом исследовании аликвот из разведения с концентрацией 10⁵ клеток/мл приходилось просматривать больше полей зрения, и не в каждом из них обнаруживались клетки трихомонад. В среднем при микроскопии нативного препарата обнаруживались 1—2 клетки в поле зрения, при микроскопии окрашенного препарата — 2—3 клетки в поле зрения. Разведение клеточной суспензии до 104 клеток/мл привело к тому, что при анализе 100 полей зрения было обнаружено всего несколько клеток простейшего при микроскопии нативного препарата. Согласно существующим рекомендациям, положительным результатом теста считается наличие хотя бы одного подвижного простейшего при микроскопии нативного препарата или хотя бы одного простейшего с типичной морфологией T. vaginalis при микроскопии окрашенного препарата в одном из 5 полей зрения [2]. В реальной лабораторной практике клетки трихомонад располагаются среди большого количества других клеток организма человека (зрелые эпителиальные клетки и их предшественники, лейкоциты, макрофаги, клетки сперматогенеза, дрожжеподобные грибы и др.) и бактериальной микрофлоры, присутствующих в биологическом материале. Это приводит к трудностям в выявлении единичных клеток простейших. Таким образом, установленным нами пределом обнаружения микроскопического метода в условиях чистой культуры T. vaginalis следует считать значение более 10⁵ клеток/мл, а при исследовании биологического материала от пациентов эта величина может быть больше.

При проведении культурального исследования нами были получены следующие результаты: при высокой концентрации клеток простейших в разведении (более 10⁵ клеток/мл) после 2 сут инкубации на исследованных питательных средах во всех полях зрения микроскопа было зафиксировано более 200 клеток трихомонад. Причем содержание неподвижных клеток составляло не более 3—4%, что соответствует экспоненциальной фазе роста микроорганизма. При уменьшении концентрации клеток простейших в разведении до 104 клеток/мл через 4 сут культивирования на коммерческих питательных средах были выявлены единичные подвижные клетки T. vaginalis не в каждом поле зрения микроскопа. При содержании простейших в исследуемом разведении 10³ клеток/мл, зафиксировано не более 1 клетки не в каждом поле зрения микроскопа только для среды СВТ через 4 сут культивирования. Дальнейшая инкубация образцов не приводила к увеличению содержания клеток, и через 7 сут культивирования в этих пробирках со средой СВТ были выявлены только неподвижные клетки трихомонад. На средах НПО Диагност-Мед и Himedia при данной посевной дозе через 96 ч культивирования выявлялись только единичные неподвижные клетки трихомонад.

При культивировании на питательной среде СВТ+L-41, даже если концентрация клеток простейших в разведении составляла 102 клеток/мл, в каждом поле зрения микроскопа насчитывалось более 200 особей. Разница была лишь в том, что указанный количественный уровень достигался за разное время культивирования — от 2 до 7 сут. Минимальная концентрация простейших в разведении, при которой наблюдался рост на среде СВТ+L-41, составила всего 10 клеток/мл.

Таким образом, установленный нами предел обнаружения культурального метода с использованием серийно производимых сред составил более 10³ клеток/мл, а при культивировании T. vaginalis в питательной среде СВТ в присутствии клеточной линии L-41 предел обнаружения составил более 10 клеток.

При исследовании с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР и НАСБА в реальном времени получены самые низкие значения пределов обнаружения. Для ПЦР предел обнаружения соответствовал разведению 1,45 кл/мл. Однако при данном разведении ДНК T. vaginalis детектировалась в 1 из 3, а РНК T. vaginalis - в 2 из 3 тестирований. Воспроизводимое при 3-кратных тестированиях обнаружение ДНК и РНК T. vaginalis было получено для разведения с концентрацией трихомонад более 10 клеток/мл.

Диагностика урогенитального трихомониаза базируется на лабораторном выявлении T. vaginalis в биологическом материале. В настоящее время существуют три основные группы методов лабораторного выявления T. vaginalis: микроскопия нативного или фиксированного препаратов, культуральный посев и выявление нуклеиновых кислот возбудителя. Выбор метода диагностики определяется рядом факторов, включающих его эффективность в выявлении возбудителя, трудоемкость, продолжительность, себестоимость и др. Благодаря крупным размерам, характерной морфологии и подвижности влагалищные трихомонады хорошо видны в световой микроскоп, а само исследование благодаря простоте выполнения, низкой себестоимости и скорости получения результата является одним из наиболее распространенных методов диагностики. Технология культивирования T. vaginalis имеет длительную историю и достигла высокого уровня. Трихомонады хорошо делятся в условиях in vitro и способны хорошо расти на искусственных питательных средах. Разработано более десятка протоколов и методик культивирования, серийно выпускается большое количество вариантов питательных сред. Культуральные методы рассматриваются как «золотой стандарт» диагностики. Тем не менее в последние годы все большее практическое применение получают МАНК, которые постепенно приобретают статус методов выбора. Как за рубежом, так и в нашей стране, серийно производятся наборы реагентов для выделения ДНК T. vaginalis (ПЦР, ПЦР в реальном времени и др.) и РНК T. vaginalis (TMA — Transcription mediated amplification, НАСБА). Помимо постоянного совершенствования технологических характеристик МАНК (скорость получения результатов лабораторного исследования, автоматизация и информатизация лабораторного процесса) основное значение играют высокие аналитические характеристики МАНК — аналитическая чувствительность и высокая специфичность. На данный момент установлены значения ДЧ для основных методов диагностики трихомониаза. ДЧ микроскопии установлена в пределах 30—70%, культурального метода — 60—95%, МАНК — от 85 до 98—100% [3—7].

Первое исследование, в котором была установлена прямая зависимость между количеством T. vaginalis в образце и диагностической чувствительностью микроскопического метода, — работа A. Philip и соавт. [8]. Авторы разработали методику культивирования T. vaginalis на агаризированной культуральной среде с подсчетом колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл). Используя эту методику, авторы определили содержание простейших у обследованных пациентов и сравнили полученные результаты с клиническим статусом и долей положительных результатов, полученных с помощью микроскопии. Содержание возбудителя в биологическом материале варьировало от 40 до 10⁶ КОЕ/мл. Возбудитель обнаруживался микроскопически, если его содержание в биологическом материале превышало 10⁵ КОЕ/мл. У пациентов, имеющих значения, превышающие этот порог, инфекция протекала преимущественно с клиническими проявлениями, и, наоборот, среди бессимптомных лиц преобладали те, у кого концентрация возбудителя была ниже порога обнаружения микроскопическим методом. Таким образом, было показано, что бессимптомная трихомонадная инфекция чаще всего сопровождается низким уровнем возбудителя в организме и, следовательно, хуже диагностируется с помощью микроскопии. Учитывая то, что для формирования колонии необходима как минимум одна живая клетка простейшего, то полученное авторами значение предела обнаружения метода микроскопии соответствует значению, полученному в нашем исследовании.

Протоколы культивирования T. vaginalis, применяемые в рутинной лабораторной практике, основаны на использовании бесклеточных питательных сред, производимых как серийно, так и в бактериологических лабораториях. ДЧ культурального метода может значительно варьировать в зависимости от состава питательной среды и качества ее компонентов. Тем не менее полученные нами результаты не выявили разницы между средами разных производителей. Предел обнаружения при культивировании T. vaginalis в питательных средах был ниже, чем при микроскопии, что, как уже было отмечено, и обеспечивало более высокую ДЧ культурального метода. В нашем исследовании для видимого роста возбудителя в среде необходимо, чтобы его концентрация была не меньше 10³ клеток/мл. Данная величина предела обнаружения соответствует экспериментально установленному значению, полученному ранее [9]. Установлено, что для инициирования детектируемого роста культуры T. vaginalis, необходимо, чтобы в ней присутствовало не менее 3×10³ клеток/мл простейших. В той же работе, как и в ряде других [10, 11], было показано, что для культивирования T. vaginalis cо значительно меньшей начальной концентрацией простейших необходимо наличие эукариотической клеточной линии (McCoy), которая создает условия, более близкие к естественной среде обитания трихомонад. В этом случае для начала роста культуры достаточно всего 2—3 клеток T. vaginalis. В нашем исследовании мы также оценивали эффективность культурального выявления трихомонад в присутствии клеточной линии (L-41). В результате предел обнаружения снизился до

14,5 клеток/мл, что полностью согласуется с данными G. Garber и других авторов. К сожалению, несмотря на столь высокую чувствительность метода культивирования T. vaginalis на эукариотических клеточных линиях, его применение в клинической лабораторной практике весьма проблематично.

Среди методов диагностики трихомонадной инфекции самая высокая диагностическая чувствительность принадлежит МАНК, которая обеспечивается самым низким пределом обнаружения возбудителя, что в свою очередь определяется рядом условий при разработке амплификационных методик. В частности, для выявления ДНК T. vaginalis разными вариантами ПЦР большое значение имеет выбор генетической мишени. Ранее было показано, что доля выявленных с помощью ПЦР случаев трихомонадной инфекции в значительной степени зависела от выбора генетической мишени для амплификации и структуры праймеров [12]. Наибольшей чувствительностью обладали методики, в которых использовали праймеры к генетическим повторяющимся элементам T. vaginalis, насчитывающие несколько сотен копий на геном простейшего [13].

К этому следует добавить, что они высокоспецифичны для влагалищной трихомонады и не обнаружены в геномах других простейших, включая близкородственные виды трихомонад — T. tenax, T. gallinae и Pentatrichomonas hominis [14]. В состав наборов реагентов АмплисенсT.vaginalis-Fl, использованных в данном исследовании, также включены праймеры и гибридизационные зонды, направленные на выявление указанных генетических мишеней. Благодаря этому, а также оптимизации протокола экстракции и амплификации ДНК, нам удалось достичь самого низкого предела обнаружения, соответствовавшего концентрации 1 клетка/мл. Ранее Е.В. Шипицыной и соавт. [15] было проведено исследование диагностической чувствительности разных методов диагностики трихомонадной инфекции, а также оценен предел обнаружения наборов реагентов на основе ПЦР разных производителей с использованием cтандарта T. vaginalis ATCC 30001D. Самый низкий среди наборов других производителей предел обнаружения (самая высокая аналитическая чувствительность) оказался при использовании АмплисенсT.vaginalis-Fl, что определило диагностическую чувствительность и специфичность, равную 100%. Предел обнаружения методики на основе НАСБА был несколько ниже, чем ПЦР, что согласуется с результатами нашего предыдущего исследования, проведенного на чистой культуре T.vaginalis, и объясняется высокой копийностью мишеней для НАСБА — молекул 18S-РНК. Более высокая чувствительность метода амплификации рибосомальной РНК продемонстрирована в работе M. Nye и соавт. [16] с использованием серийно выпускаемого теста ATV TMA («Gen-Probe Inc.», США) на основе технологии TMA.

В результате исследования установлено, что среди методов выявления T. vaginalis, используемых в лабораторной диагностике трихомониаза, наибольшей аналитической чувствительностью (наименьшим пределом обнаружения) обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА на основе наборов реагентов Амплисенс, а наименьшей аналитической чувствительностью — микроскопические методы. Чувствительность культурального метода была выше, чем метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК.