Изучение действия низкоинтенсивного лазерного излучения на экспрессию генов матриксных металлопротеаз в культуре клеток кератиноцитов человека

Матриксные металлопротеазы (MMП) представляют собой семейство цинксвязывающих протеолитических ферментов. Основная функция MMП — ремоделирование и деградация внеклеточного матрикса и клеточных мембран при различных биологических процессах, например формировании скелета, эмбриональном развитии, ангиогенезе, клеточной миграции, ранозаживлении и др. [1, 2]. Помимо этого, показано участие ММП во врожденном иммунитете, в частности в активации металлопротеазами антимикробных белков — про-α-дефензинов, и быстрой репарации поверхности поврежденного эпителия [3]. Важна их роль и в воспалительном процессе (миграция макрофагов и лимфоцитов, регуляция проницаемости сосудов, регуляция активности воспалительных медиаторов — цитокинов и хемокинов [4]). MMП-1 входит в состав промежуточных коллагеназ, играющих важную роль в расщеплении фибриллярного коллагена типов I–III [2]. MMП-1 идентифицирована во многих тканях, в которых происходит ремоделирование при физиологических процессах и патологиях. Например, при заживлении ран MMП-1 экспрессируется в кератиноцитах и регулирует клеточную миграцию посредством связывания α2β1-интегрина и коллагена типа I, при котором происходит деградация коллагена и соответственно ремоделирование межклеточного матрикса [5].

MMП-2 и MMП-9 представляют семейство гелатиназ и обладают сходной протеолитической активностью. MMП-2 и MMП-9 расщепляют нативные коллагены IV, V, VII, X типа, фибропектин, остеонектин, энтаксин, ламинин, витронектин, декорин, гелатин и аггрекан, некоторые хемокины (CCL7 и СXCL12), предшественников TNF и про-TNF-β. Кроме того, MMП-9 расщепляет аналогичные компоненты внеклеточного матрикса, при этом его субстратами являются коллагены XI и XIV типа [2, 6, 7]. MMП-2, как и коллагеназы, также расщепляет нативные коллагены I–III типа [8]. Однако коллагенолитическая активность MMП-2 значительно меньше, чем у коллагеназы MMП-1 [9]. Дополнительно MMП-2 активируют про-MMП-1 и про-MMП-9, а MMП-9 — цитокины, как, например, интерлейкин-1β и TGF-β [10, 11].

Большинство MMП in vivo не экспрессируются конститутивно, их экспрессия индуцируется посредством различных экзогенных сигналов — факторов роста (EGF, BFGF), цитокинов (фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1β), а также химических агентов и физического стресса. Внеклеточные стимулы через пути передачи сигнала приводят к активации транскрипционного фактора AP-1, сайты связывания с которым есть у MMP-1, ММР-9 и ММР-12 [12].

Таким образом, представляется актуальным изучение активности генов ММП (MMP) при воздействии низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм на кератиноциты человека. В данной работе методом ПЦР в реальном времени изучали уровень экспрессии генов ММП – ММР-1, ММР-2, ММР-12 в иммортализованных кератиноцитах человека при воздействии лазерного излучения.

Опыты проводили на клетках линии HaCaT — иммортализованных (постоянно делящаяся линия) кератиноцитах человека.

Состав среды для культивирования клеток: DMEM («Gibco») — модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, дополненная фетальной телячьей сывороткой (FВS; «Gibco»), 10 мкл/мл гентамицин (может быть заменен на другой антибиотик). Условия культивирования: 37 °С, 5% СО₂, среду меняли через 2—3 сут культивирования. Для снятия клеток с культурального пластика при пересеве использовали 0,25% раствор трипсина в растворе Версена («Панэко»; 10 мин при 37 °С, 5% СО₂). Для длительного хранения клетки замораживали в жидком азоте в присутствии в составе питательной среды 10% ДMСO (диметилсульфоксид).

Для проведения опыта клетки наносили на культуральный пластик (1 млн клеток на чашку диаметром 10 см). Накануне опыта меняли питательную среду. К моменту облучения клетки достигли монослоя. Их обрабатывали в асептических условиях низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм (экспозиция обработки 1 и 5 мин, расстояние 2—3 см).

Через 2 ч культивирования после проведения облучения клетки промывали фосфатно-солевым буфером, затем обрабатывали лизирующим буфером RLT для выделения РНК. РНК (на колонках Qiagen) выделяли по следующей методике. К фрагменту ткани добавляли 300 мкл RLT-буфера, содержавшего β-ME, и немедленно гомогенизировали. Затем к гомогенату добавляли 590 мкл ddH2O и 10 мкл протеиназы K (10 мг/мл; «AppliChem», США) и перемешивали пипетированием. Инкубировали 10 мин при 55 °С. Затем центрифугировали 3 мин при 10 000g при комнатной температуре. Супернатант (около 900 мкл) переносили в новую пробирку.

К супернатанту добавляли половину объема (около 450 мкл) этанола 96%. Далее 700 мкл образца, включая преципитат, переносили на RNeasy mini колонку, вставленную в 2-миллилитровую пробирку. Центрифугировали 15 с при более чем 8000g (10 000 об/мин). Жидкость из пробирки удаляли и повторяли предыдущий этап.

Колонку промывали 350 мкл Buffer RW1, после чего обрабатывали ДНК-азой. Для этого добавляли 10 мкл исходного раствора DNase I с 70 мкл Buffer RDD на поверхность силикагеля и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Колонку промывали 350 мкл Buffer RW1 и дважды 500 мкл Buffer RPE. РНК элюировали 50 мкл RNAase-free H2O. Для проведения следующего этапа исследований на матрице РНК синтезировали кДНК.

Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл вносили буфер, dNTP, 100 ЕД обратной транскриптазы M-MLV («Promega»), 20 ЕД ингибитора РНКаз RNasin («Promega»), случайные гексануклеотидные праймеры («Promega») и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 ч при 37 °С.

Для контроля выделения РНК и обратной транскрипции, а также нормализации количества РНК в образцах проводили ПЦР с праймерами на «ген домашнего хозяйства» GAPDH (forward primer 5’-TGCMTCCTGCACCACCAACT, reverse primer 5’-YGCCTGCTTCAC CACCTTC). Для анализа качества выделенной РНК и синтезированной кДНК проводили ПЦР.

ПЦР проводили в объеме 20 мкл в пробирках для ПЦР объемом 200 мкл. Использовали следующие компоненты реакционной смеси: однократный ПЦР-буфер, 1 ЕД акт. Taq I ДНК-полимеразы, 0,2 мМ dNTP, по 5 pmol праймеров («прямой» и «обратный»).

ПЦР проводили в ПЦР-амплификаторе («MJ Research», США) по следующей программе: 1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин, 2) денатурация при 94 °С в течение 45 с, 3) отжиг при 58 °С в течение 45 с, 4) элонгация при 72 °С в течение 45 с, 5) этапы 2—4 повторяли 30 раз, 6) элонгация при 72 °С в течение 7 мин.

Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле в буфере TAE (40 мM Трис-НСl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ СН3СООН). Использовали гели из 2% агарозы.

Для визуализации продуктов амплификации ПЦР использовали бромистый этидий. Краситель добавляли в гель в процессе его приготовления до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты электрофореза визуализировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В качестве стандарта длины и количества ДНК использовали 7 мкл маркера (1 kb, «Promega»).

Для анализа уровня экспрессии изучаемых генов выполняли ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX («Синтол»).

Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез».

Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе («Bio-Rad», «iQ4»), используя следующую программу: 1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин, 2) денатурация при 94 °С в течение 15 с, 3) отжиг при 58 °С в течение 15 с, 4) элонгация при 72 °С в течение 15 с, 5) этапы 2-4 повторяли 35 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. Амплификацию гена GAPDH и исследуемых генов проводили в разных пробирках.

Обработку результатов ПЦР проводили методом 2-ΔΔCT, согласно опубликованной ранее методике [13].

Эксперименты проводили в 3 повторах для каждого образца.

С использованием метода ПЦР в реальном времени проведен анализ уровня экспрессии генов ММР-1, ММР-2, ММР-12 и FOSL1 в клетках линии HaCaT до и после обработки низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм и экспозицией обработки 1 и 5 мин.

Экспрессия всех исследуемых генов через 2 ч после обработки низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм и экспозицией обработки 1 мин была значительно снижена по сравнению с контролем. Через 6 ч после обработки лазерным излучением с экспозицией 1 мин экспрессия генов ММР-1, ММР-2, ММР-12 повышалась. Через 24 ч экспрессия всех генов была разнонаправленной (рисунок, а—в).

Через 2 ч после обработки низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1,27 мкм и экспозицией обработки 5 мин экспрессия генов ММР-1, ММР-2, ММР-12 была значительно снижена по сравнению с контролем, так же как и при экспозиции 1 мин.

Результаты обработки клеток в течение 1 и 5 мин через 2 ч культивирования достоверно не различались, в обоих случаях наблюдалось снижение уровня экспрессии генов ММР-1, ММР-2, ММР-12. Следовательно, можно заключить, что время экспозиции лазерного излучения существенно не влияет на изменение экспрессии этих генов. Поскольку существенное снижение уровня экспрессии происходило непосредственно после воздействия на культуру, что является быстрым ответом клеток на лазерное излучение, то результаты, полученные через 2 ч культивирования, возможно, являются наиболее объективными.

Поскольку культивируемые нами клетки находятся вне иммунной системы организма, то увеличение периода культивирования после обработки клеток, вероятно, не обеспечит объективную оценку клеточного ответа на облучение.

Возможным объяснением увеличения экспрессии ММП может быть то, что они являются триггерами МАР-киназного пути, оксидантного и нитратного стресса, каспаза-опосредованной клеточной смерти, эксайтотоксичности и нейровоспаления [14, 15].

Работа выполнена при поддержке Гос. Контракта (ГК) – 1309 «Кадры» и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».