Урогенитальный трихомониаз относится к наиболее распространенным заболеваниям, передающимся половым путем. В настоящее время в течении трихомониаза преобладают вялотекущие, малосимптомные или бессимптомные формы заболевания, характеризующиеся выделением большого числа атипичных возбудителей, что создает трудности при лабораторной диагностике трихомониаза [1]. Выявление по цитоморфологическим характеристикам атипичных форм трихомонад может способствовать повышению результативности лабораторной диагностики стертых форм заболевания.

Влагалищные трихомонады встречаются в двух основных формах: амебоидной и цистоподобной. По мере изучения трихомонад исследователи отмечали различные морфологические особенности у измененных форм возбудителя. Ю. Терас [2] описывает округлые формы возбудителя, очень устойчивые к воздействующим факторам. Т.М. Ткаченко [3] при изучении биологии трихомонад, характеризует цистоподобные формы как неподвижные безжгутиковые клетки возбудителя, округлой или овальной формы, размером от 8 до 22 мкм, без волнообразной перепонки. Зарубежные исследователи отмечают у округлых безжгутиковых форм трихомонад наличие просветления по периферии клетки и колебания размеров от 10 до 100 мкм [4, 5]. При изучении размножения трихомонад в культуре у округлых неподвижных форм возбудителя была выявлена способность к реверсии. Рост типичных жгутиковых форм трихомонад был получен путем ряда пассажей округлых форм на свежие питательные среды [6]. Описаны также округлые трихомонады как резко контурированные формы, обладающие низким метаболизмом и не способные размножаться на питательных средах или размножающиеся с трудом [7].

При изучении культуральных свойств трихомонад и оценке антибиотикорезистентности исследователи отмечают у сферических форм блестящую оболочку, зернистое содержимое и более интенсивную окраску по сравнению с типичными формами возбудителя [8, 9]. При исследовании трихомонад путем растровой микроскопии экспериментаторы отмечают у округлых форм толстую ярко светящуюся оболочку [10]. М.М. Васильев [11] при моделировании трихомонадной инфекции на животных выделил из очага поражения округлые формы возбудителя, отметив у них при микроскопии многослойную оболочку. Ученые индуцировали появление округлых форм трихомонад, обладающих множеством ядер и способных соединяться в конгломераты с последующим распадом колоний под влиянием мутагена нитрозогуанидина и инфракрасного излучения [12, 13]. Амебоидные формы трихомонад характеризуются размерами до 35 мкм и выраженными псевдоподиальными выступами клеточной оболочки.

Наличие светлой или блестящей неоднослойной оболочки у атипичных форм возбудителя, особенно у округлых форм, можно объяснить выраженными у таких форм оптическими свойствами, в частности, способностью к дифракции и интерференции [14]. Методы интерферометрии позволяют оценить морфологию прозрачных микрообъектов, обладающих выраженными оптическими свойствами. Световая волна при встрече с таким микрообъектом претерпевает отражение и в зависимости от характера его поверхности при наблюдении проявляются линии интерференции, повторяющие форму объекта. Для изучения оптических свойств микрообъектов в НИИ разработаны специальные интерференционные микроскопы [15, 16]. Однако для большинства диагностических лабораторий такие микроскопы недоступны, а оптические свойства возбудителей можно наблюдать в обычный световой микроскоп.

Исходя из поставленной проблемы, цель работы — исследование наличия оптических свойств у форм Trichomonas vaginalis с позиций процессов дифракции и интерференции.

Оптические свойства форм влагалищных трихомонад изучали в условиях эксперимента путем обычной микроскопии с использованием светофильтров (λф., λс., λж., λк.) нативных препаратов культуры возбудителя. Культивирование проводили при использовании среды Тераса путем посева клинического материала, взятого из заднего свода влагалища и цервикального канала шейки матки у женщин с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ). Различные атипичные формы трихомонад получали из типичных клеток в условиях эксперимента в среде Тераса при добавлении 2,5% растворов гормональных препаратов синестрола и прогестерона в соотношении 1:10. Размеры трихомонад измеряли с помощью окулярного микрометра. При определении коэффициента преломления среды использовали рефрактометр Аббе, глубину расположения форм по отношению к поверхности стекла наблюдали путем микроскопии с использованием микрометрического винта со шкалой. Микрофотографирование проводили с помощью цифровой фотокамеры Webbers Myscope 300M. Расчеты интерференционной картины проводили согласно основным приемам оптических исследований [14].

Явление загибания световой волны, встретившей препятствие, в область геометрической тени носит название дифракции. Геометрическая тень возникает в пространстве за препятствием (каким-либо объектом). На рис. 1

Одним из видов дифракции, объясняющим образование внешних колец вокруг объекта, является дифракция на круглом экране. Круглый экран является препятствием на пути распространения света, в таком случае лучи 1´ и 2´ испытывают дифракцию и отклоняются на угол α в сторону от центра экрана точки Р, в область внешней геометрической тени. Вследствие этого возникающая дифракционная картина имеет вид светлой центральной области, окруженной кольцевыми чередующимися зонами света и тени, а по мере удаления от центра кольца становятся все менее резкими и вдали получается равномерное освещение. При данном виде дифракции возможно отклонение световых лучей и в область внутренней геометрической тени, что наблюдается в виде «внутренних» дифракционных колец.

Возникновение дифракционной картины, наблюдаемой как вне, так и внутри геометрической тени, объясняется явлением дифракции на круглом отверстии. В данном случае окружающая среда является подобием экрана, а более прозрачный объект служит отверстием в этом экране. Лучи света 1̋ и 2̋, испытав дифракцию при встрече с объектом, отклоняются от первоначального пути в область внутренней геометрической тени и при наблюдении появляется картина в виде чередования светлых и темных колец, не выходящих за пределы объекта. При данном виде дифракции возможно также отклонение лучей в пределах внешней геометрической тени, что наблюдается в виде внешних дифракционных колец.

Под интерференцией света понимают явление наложения двух или нескольких световых волн при условии, если они когерентны. Волны называются когерентными, если разность хода между двумя приходящими в данную область волнами постоянна. Результирующее гармоническое колебание, возникающее в процессе наложения двух волн, не равняется сумме амплитуд складывающихся колебаний в случае когерентных волн. Интерференционная картина, начинающаяся в тонкой прослойке воздуха между стеклянной пластиной и соприкасающейся с ней плосковыпуклой линзой и дающая при наблюдении вид концентрических колец, называется кольцами Ньютона. Плосковыпуклая линза характеризуется сферической поверхностью с определенным радиусом кривизны.

На рис. 2

где κ – порядковый номер кольца;

λ – длина волны;

R – радиус кривизны;

n – коэффициент преломления среды;

n=1,351.

Условием минимума интерференционной картины является выражение Δl = ±(2κ+1)·λ/2, после преобразования которой получается формула 2 для расчета радиусов темных колец Ньютона (rт):

Описанная оптическая картина возникает у округлых форм влагалищных трихомонад при микроскопии нативных препаратов, изготовленных методом раздавленной капли. При этих условиях округлые безъядерные формы Trichomonas vaginalis с выраженной оболочкой являются преградой (круглым экраном) на пути распространения света, световая волна испытывает дифракцию, и при микроскопии вокруг форм наблюдаются внешние дифракционные кольца. В некоторых случаях, удовлетворяющих геометрии опыта, вокруг трихомонад наблюдаются как внешние дифракционные кольца, так и кольца, расположенные на поверхности формы в пределах внешних границ. Данный случай объясняется явлением дифракции от круглого отверстия. Это наблюдается в условиях эксперимента, когда питательная среда менее прозрачна, а округлые формы возбудителя на пути прохождения света являются подобием более прозрачного кр углого отверстия в среде. Свет распространяется (как показано на рис. 2), и наблюдаются дифракционные кольца, расположенные на поверхности формы. В рассмотренном случае образуются также внешние кольца. В случае соприкосновения округлых форм с поверхностью стекла наблюдаются одновременно два явления; внешние кольца, окружающие формы, имеют дифракционную природу, а образование колец, расположенных на поверхности округлых клеток Trichomonas vaginalis, объясняется явлением интерференции света типа колец Ньютона. В данном случае при частичном высушивании питательной среды трихомонады, так называемые ‹‹блестящие›› формы, проявляющие себя как плосковыпуклые линзы, оседают на поверхность стекла и образуют оптическую систему «стекло-прослойка питательной среды-трихомонада (линза)». При освещении названной системы образуются кольца Ньютона (см. рис. 1). Доказательством интерференционной природы «внутренних» колец служат проведение эксперимента в условиях индуцированного прилипания трихомонад к поверхности стекла при небольшом высушивании капли, когда формы еще не деформировались и не изменили оптических свойств, а также наблюдение за распределением форм по глубине в капле относительно верхней и нижней границ стекла.

Оптические свойства влагалищных трихомонад, выращенных в среде Тераса, отражают рис. 3-11.

На рис. 3-6 отражается морфология влагалищных трихомонад, выделенных путем культивирования от больных с ВЗОМТ. Округлые и амебоидные формы возбудителя имеют ярко выраженные внешние кольца, на некоторых формах заметны и кольца, расположенные на самой поверхности клетки трихомонады. Проявление данных оптических свойств объясняется явлением дифракции света.

Рис. 7-11 отражают внешнюю дифракционную и «внутреннюю» интерференционную картину, возникающую при просмотре атипичных форм трихомонад в разных участках оптического спектра в условиях индуцированного прилипания. На рис. 7 показана округлая безъядерная форма Trichomonasvaginalis, имеющая размер 16,2×21,6 мкм, с блестящей оболочкой, окруженной дифракционными кольцами. При наблюдении культуры трихомонад в белом свете, без применения светофильтра, заметно проявление незначительного числа окрашенных интерференционных колец. Данная особенность интерференции возникает вследствие наложения разных длин волн, что не позволяет наблюдать резко выраженную интерференционную картину, как в случае монохроматического света.

На рис. 8 показана та же форма культуры Trichomonas vaginalis, но при рассмотрении простейшего в коротковолновой части спектра с длиной волны 415 нм. При наблюдении через фиолетовый светофильтр эта атипичная форма возбудителя имеет на поверхности 12 колец Ньютона, проявляющихся в чередовании интерференционных максимумов и минимумов. Радиус кривизны линзообразной поверхности трихомонады, соприкасающейся со стеклянной плоскостью, определяется из формулы 2 и вычисляется на примере радиуса темного кольца Ньютона, практически совпадающего с фиолетовой частью спектра с радиусом округлой трихомонады по формуле 3:

R = n·r²/(2κ–1)·λ/2; R = 69,05 мкм. (3)

По известному радиусу кривизны, который является постоянной величиной для данного размера трихомонады, согласно формуле 2, вычисляются радиусы темных интерференционных колец Ньютона в фиолетовой части спектра. Исходя из полученных данных, радиус первого темного кольца, считая из центра, rт1ф = 3,26 мкм, rт2ф = 5,64 мкм, rт3ф = 7,28 мкм, rт4ф = 8,62 мкм, rт5ф = 9,77 мкм, rт6ф = 10,80 мкм (здесь и далее буквы обозначают цвета светофильтра (фиолетовый, синий, желтый, красный)). Если сопоставить вычисленные радиусы с радиусами, полученными при измерении с помощью микрометра, то получаются примерно одинаковые величины.

Рис. 9 отражает морфологию выбранной атипичной формы Trichomonas vaginalis при просмотре культуры в синей части спектра с характерной λ = 440 нм. На поверхности формы заметно шесть темных интерференционных колец Ньютона, имеющих следующие радиусы rт1с = 3,35 мкм, rт2с = 5,81 мкм, rт3с = 7,50 мкм, rт4с = 8,87 мкм, rт5с = 10,06 мкм, rт6с = 11,12 мкм. Сравнивая радиусы колец Ньютона одного порядкового номера, при просмотре формы возбудителя в фиолетовой и в синей части спектра, мы видим увеличение величин радиусов.

На рис. 10 показаны атипичные формы трихомонад, с выраженной зоной интерференционных колец на поверхности клетки, при просмотре культуры в желтой части спектра с характерной λ=585 нм. Согласно экспериментальным данным, величины радиусов темных колец Ньютона, характеризующих морфологию сферической формы трихомонады, следующие: rт1ж = 3,87 мкм, rт2ж = 6,70 мкм, rт3ж = 8,64 мкм, rт4ж = 10,23 мкм, rт5ж = 11,60 мкм, rт6ж = 12,82 мкм (рис. 10).

На рис. 11 отражена морфология округлой формы трихомонады, с выраженной интерференционной картиной, наблюдаемая при просмотре культуры в красной части спектра с характерной λ = 695 нм. При расчете, согласно экспериментальным данным, получены следующие величины радиусов темных колец Ньютона: rт1к = 4,21 мкм, rт2к = 7,30 мкм, rт3к = 9,42 мкм, rт4к = 11,15 мкм, rт5к = 12,64 мкм, rт6к = 13,86 мкм.

Согласно расчетам интерференционной картины, возникающей на поверхности формы трихомонады, с увеличением порядкового номера кольца Ньютона, расстояния между кольцами уменьшаются, центральные кольца выглядят наиболее широкими. При просмотре культуры трихомонад в разной части оптического спектра наблюдается увеличение радиусов интерференционных колец соответствующего порядкового номера при переходе от фиолетовой части спектра к красной, что определенно указывает на интерференционную картину типа колец Ньютона.

У амебоидных форм трихомонад заметен ярко выраженный светлый ореол вокруг оболочки, что можно объяснить явлением дифракции света, а интерференционных колец не наблюдается, что определяется формой возбудителя (рис. 4).

Проведенные исследования морфологии атипичных форм T. vaginalis с позиций явлений дифракции и интерференции определенно указывают на проявление выраженных оптических свойств в виде дифракционных колец и интерференционных линий типа колец Ньютона, особенно у округлых безъядерных форм возбудителя. Выраженные оптические свойства в поверхностных слоях атипичных клеток трихомонад характеризуют особые физико-химические свойства оболочки у таких форм возбудителя. Наличие выраженных оптических свойств у атипичных форм трихомонад может служить идентификационным признаком названных форм.