Термином «хронический панкреатит» (ХП) обозначают «группу хронических заболеваний поджелудочной железы (ПЖ) различной этиологии, преимущественно воспалительной природы, с фазово-прогрессирующими очаговыми, сегментарными или диффузными дегенеративными или деструктивными изменениями ее экзокринной ткани, атрофией железистых элементов (панкреоцитов) и замещением их соединительной (фиброзной) тканью; изменениями в протоковой системе ПЖ с образованием кист и конкрементов, с различной степенью нарушения экзокринной и эндокринной функций» [3].

Приведенное определение наиболее полно соответствует морфологическим изменениям, происходящим в поджелудочной железе при хроническом воспалительном процессе и сопровождающимся разрастанием соединительной ткани из периваскулярной ткани, соединительной ткани канальцев, выводных протоков с последующим рубцеванием и склерозом поджелудочной железы. Соединительная ткань может развиваться между дольками или внутри них, этот процесс может диффузно поражать всю железу, но иногда может отмечаться локальное ее поражение [2, 7, 9]. Развитие соединительной ткани сопровождается образованием новых капилляров.

Интенсивные исследования в области молекулярных механизмов ангиогенеза привели к открытию ряда важнейших регуляторов этого сложного процесса, в частности была выяснена роль цитокинов - факторов роста, специфически влияющих на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток микрососудов и последующую их дифференциацию [1, 4-6, 8]. В современной литературе в достаточной мере не проанализированы морфология микрососудов, их клеточное окружение и функциональное состояние клеток развивающейся соединительной ткани при ХП.

В рамках проведенного исследования была поставлена задача - сравнить структурно-функциональное состояние клеток, участвующих в секреции одного из наиболее распространенных стимуляторов ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), с данными иммуногистохимического исследования.

Материал для исследования получали из хирургических отделений ГКБ им. С.П. Боткина, клинической больницы №119, Института хирургии им. А.В. Вишневского. Выполнен анализ операционного материала 40 больных ХП, находившихся на лечении в указанных выше медицинских учреждениях в период с 2007 по 2009 г.

Среди больных ХП преобладали мужчины (3:1). Возраст больных колебался от 40 до 80 лет. Средний возраст мужчин 56,5 года, средний возраст женщин  54 года.

Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуноморфологическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 2 мкм стрептавидин-биотин-пероксидазным методом, используя систему Ultra Vision LP («LabVision»), и визуализацию с помощью диаминобензидина и докрашивания ядер гематоксилином фирмы «Shandon» по стандартной методике, рекомендованной фирмой производителем с применением антител к ФРЭС («LabVision»). Позитивным контролем для иммуногистохимических реакций являлись реакции на неизмененной ткани ПЖ (аутопсийный материал). Интенсивность реакций оценивали полуколичественным методом: (–/0) - отрицательная, (+/1) - слабая, (++/2) - средняя, (+++/3) - интенсивная. Проведено электронно-микроскопическое исследование биоптатов ПЖ от 10 больных. Кусочки ткани для исследования фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида и в 1% растворе ОsO4 и заключали в смесь аралдитовых смол. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе фирмы «Philips» MC-10 в трансмиссионном режиме при ускоряющем напряжении 80 кВ. Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 6.1. Силу и значимость связи между анализируемыми признаками оценивали с помощью корреляционного анализа. Для количественных признаков вычисляли корреляционный коэффициент Пирсона. За уровень статистической значимости принимали р<0,05.

Важными морфологическими составляющими ХП любой этиологии являются отек, воспаление и очаговые некрозы ткани ПЖ. При этом происходит инфильтрация ткани клетками воспаления - лимфоцитами, лейкоцитами, макрофагами, тучными клетками. По данным нашего исследования, большинство макрофагов находилось в функционально активном состоянии, о чем свидетельствует ультраструктура клеток. Наиболее характерными признаками активности клеток являются большое количество цитоплазматических выростов на поверхности клетки, наличие в цитоплазме везикулярных структур различного размера, наличие фагосом с детритом. Макрофаги принимают активное участие в «запуске» специфического иммунного ответа, в клеточно-опосредованном иммунном ответе. Наличие в поврежденной ПЖ хронического воспаления и некротизированных тканей приводит к доминирующему положению макрофагов в инфильтрате.

В результате инфильтрации ткани клетками воспаления увеличивается содержание секретируемых ими воспалительных медиаторов, которые оказывают влияние на функциональную активность клеток от пролиферации до их гибели. Активированные макрофаги являются источником ряда факторов роста, стимулирующих пролиферацию и секреторную активность фибробластов, эндотелиоцитов. Экспрессия одного из наиболее распространенных стимуляторов ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов усиливается воспалительными медиаторами, макрофагами, тучными клетками и др.

При иммуногистохимическом исследовании экспрессия ФРЭС присутствовала в цитоплазме ацинарных клеток, эндотелиальных клетках и фибробластах. Наиболее высокие уровни ФРЭС наблюдались при умеренно выраженных фиброзных изменениях (рис. 1).

Выявлена прямая зависимость между выраженностью стромальной воспалительной инфильтрации и экспрессией сосудистого фактора (r=0,65, p<0,0002; рис. 2).

При умеренно выраженных фиброзных изменениях при электронно-микроскопическом исследовании отмечали характерные деструктивные изменения межацинарных сосудов в виде нарушения целостности эндотелиальной выстилки сосудов, утолщения, частичного расщепления и фрагментирования базальной мембраны. Важной характеристикой ФРЭС является его способность повышать проницаемость сосудов, что приводит к развитию периваскулярного отека (рис. 3).

Эндотелий сосудов находится в функционально активном состоянии, на что указывает большое количество цитоплазматических выростов на люминальной поверхности клеток и большое количество везикул в цитоплазме клеток. Люминальная поверхность клеточной мембраны (обращенная в просвет сосуда) образует цитоплазматические выросты, множественные микроворсинки, бухты, значительно увеличивающие свободную поверхность клеток. Микроворсинки, сливаясь друг с другом, образуют микровезикулы, которые, выстраиваясь в цепочку, формируют каналы, что является свидетельством активного трансэндотелиального транспорта. При интенсивном развитии микрососудов отмечали активацию секреторных и регуляторных функций эндотелия, при этом эндотелиальные клетки трансформируются в так называемый синтетический фенотип. Характерными ультраструктурными признаками таких клеток являются хорошо или умеренно развитая гранулярная цитоплазматическая сеть, увеличенные в размере митохондрии, большое количество микровезикул в цитоплазме клеток (рис. 4).

Нередкими спутниками капилляров были фибробласты удлиненной формы с умеренно или хорошо развитой гранулярной цитоплазматической сетью, что указывает на интенсивность синтетических процессов в клетке, результатом которых является синтез белка, в том числе и коллагена.

При прогрессировании фиброзных процессов в ткани ПЖ уменьшается количество макрофагов, капилляров. Увеличивается количество синтезированного фибробластами коллагена, а сами клетки переходят в малоактивное состояние (фиброциты). Коллагеновые волокна в большом количестве располагались в периваскулярном пространстве, что указывало на периваскулярный фиброз (рис. 5).

При прогрессировании склероза ПЖ отмечали гиповаскуляризацию, а также аваскулярные зоны.

В зависимости от степени фиброзных изменений мы отметили различия в выраженности экспрессии сосудистого эндотелиального фактора. Так, при фиброзных изменениях I степени выраженность эндотелиального фактора в большинстве случаев расценивалась как умеренная (2+). При фиброзных изменениях II степени отмечалась только выраженная (3+) экспрессия эндотелиального фактора, при фиброзных изменениях III степени наблюдалась наименьшая экспрессия (1+) ФРЭС клетками (ацинарными, эндотелиальными, фибробластами). Прослежена обратная статистически значимая корреляционная связь выраженности фиброзных изменений и экспрессии сосудистого фактора (r= –0,42, p=0,008; рис. 6).

Таким образом, проведенное комплексное морфологическое исследование (иммуногистохимическое, электронно-микроскопическое) выявило прямую зависимость между выраженностью стромальной воспалительной инфильтрации и экспрессией фактора роста эндотелия сосудов. С прогрессированием фиброза ПЖ отмечались уменьшение активности эндотелия сосудов и фибробластов, усиление периваскулярного фиброза, а также уменьшение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов клетками. Подобная динамика функционального состояния макрофагов, клеток сосудистой стенки и микроокружения капилляров может свидетельствовать о снижении компенсаторных возможностей клеток ПЖ в условиях прогрессирования фиброза при ХП.