Введение

При образовании развития тромба в сосудах, особенно в артериях, единственным консервативным способом восстановления кровотока является растворение (лизис) этого тромба. В связи с этим тромболитические препараты являются лекарствами первого ряда в лечении таких заболеваний [1—5].

В лаборатории генной инженерии ФГБУ «НМИЦК имени академика Е.И. Чазова» Минздрава России фундаментальные и прикладные научные исследования, направленные на разработку новых поколений тромболитических препаратов, проводятся с 80-х годов прошлого века. С использованием методов генной инженерии был создан тромболитический препарат третьего поколения, который представляет собой модифицированный рекомбинантный фибринспецифичный активатор плазминогена урокиназного типа. Активатор производится штаммом бактерии E.coli, в которую встраивается плазмида, несущая ген модифицированной молекулы нативной проурокиназы человека с заменой 24 аминокислотных остатков эндотелиального фактора роста (ЭФР) (N-концевого домена). Изменение аминокислотной последовательности ЭФР привело к тому, что синтезированная молекула не связывается со специфическими рецепторами на поверхности клеток и поэтому не способна создавать какие-либо потенциально возможные побочные эффекты, связанные с активизацией регуляторных процессов, контролирующих миграцию клеток и ремоделирование тканей. Рекомбинантная проурокиназа специфически взаимодействует с фибринсвязанным плазминогеном и катализирует превращение плазминогена в плазмин — протеазу, способную растворять фибриновые сгустки (тромбы). Исследования энзимологических и фармакокинетических свойств препарата рекомбинантной проурокиназы были проведены в лаборатории генной инженерии Института экспериментальной кардиологии [3].

Рекомбинантная проурокиназа — один из наиболее распространенных препаратов, разрешенных к применению в РФ. Наряду с препаратом «Альтеплаза», рекомбинатной производной второго активатора плазминогена, рекомбинатная проурокиназа с названием «Пуролаза» с 2000 года успешно используется для лечения инфаркта миокарда. Пуролаза в отличие от альтеплазы не нейротоксична. Оба этих фермента не являются прямыми фибринолитиками, а являются активаторами плазминогена, превращающими неактивный плазминоген в плазмин, очень короткоживущий в активированной форме из-за высокой концентрации в крови его двух энергичных ингибиторов — альфа-2-антиплазмина и альфа-2- макроглобулина.

Система «активатор—плазминоген», в которой образующийся плазмин сам является активатором исходно неактивной проурокиназы, благодаря автокаталитической цепной реакции очень быстро и локально достигает высоких концентраций. Система хорошо работает при свежих и не очень протяженных тромбозах — до 2—3 ч после образования. Нормальная концентрация проурокиназы в плазме варьирует в пределах 0,1—1 нМ, терапевтическая доза при тромболитической терапии приводит к увеличению начальной концентрации урокиназы в плазме до 200—250 нМ. Объем распределения при этом примерно соответствует объему крови, а не плазмы. Среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (МRТ) у человека при тромболитической терапии для пуролазы составляет примерно 12—15 мин при терапевтической дозе. Лечение активаторами наиболее эффективно как скоропомощное средство. При старых или протяженных тромбозах система исчерпывается до завершения растворения тромба. Концентрация плазминогена падает и повторное введение активатора становится не эффективным. Основное преимущество плазмина в качестве тромболитического средства перед его активаторами заключается в том, что плазмин является тромболитиком прямого действия. Это побудило нас создать генноинженерный плазминоген, который сам по себе или в комбинации с пуролазой может использоваться в течение долгого времени в невысоких концентрациях. Такой препарат должен быть эффективен при тромбоэмболиях, тромбозах абдоминальных артерий, венозных тромбозах и других тромбозах, требующих продолжительной процедуры, длящейся дольше 90 мин. И такой препарат был сделан. Также были получены неприродные варианты, относительно устойчивые к альфа-2-антиплазмину [6—9].

Укороченные (делеционные) варианты плазминогена, лишенные всех или части крингл-доменов с сохраненным протеазным доменом, также рассматриваются в качестве потенциального тромболитика [10, 11]. Мини-плазминоген, состоящий из 5-го крингл-домена и протеазного домена, в физиологических условиях получается в результате протеолитического расщепления молекулы плазминогена эластазой нейтрофилов. Мини-плазминоген способен активироваться точно так же, как и полноразмерный плазминоген, образуя мини-плазмин. В лаборатории генной инженерии был получен рекомбинантный вариант такого мини-плазминогена [9].

При предполагаемой схеме последовательного (сочетанного) применения тромболитиков возникла необходимость оценить влияние введения первого тромболитика на фармакокинетику второго. Наше исследование посвящено фармакокинетике урокиназы в кроликах, ранее использованных для изучения токсикокинетики препарата мини-плазминогена на кроликах, которым до введения пуролазы тромболитик не вводился.

Материал и методы

В работе участвовали кролики породы шиншилла, разделенные на две группы (по 12 голов в каждой группе), средняя масса 4,5 кг. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в «НМИЦК имени академика Е.И. Чазова» Минздрава России, рекомендациям национального совета по исследованиям, законам РФ.

Препарат кроликам вводили внутривенно в краевую вену уха.

Кровь отбирали в подготовленные пробирки с 1/10 объема 3,8% цитрата натрия через определенные промежутки времени. Полученные образцы крови центрифугировали в течение 15 мин при 2600 об/мин, а затем отбирали в стерильные пробирки плазму, замораживали в азоте и хранили до востребования при —20°C.

Пептидный субстрат и H-D-Glu-Gly-Arg-pNA (S-2444) для измерения амидолитической активности урокиназы был синтезирован в лаборатории пептидного синтеза Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии имени академика В.Н. Смирнова НМИЦК имени академика Е.И. Чазова Минздрава России.

Реакцию проводили в растворе, содержащем PBS-буфер, 24 мкл плазмы, общий объем реакционной смеси — 250 мкл. Концентрация субстрата — 0,5 мМ. Температура инкубации 37◦C. Удельная активность урокиназы на этом субстрате составляла 12,1 кат, что соответствует расщеплению 12,1 молей субстрата за 1 с 1 молем фермента.

Через 2, 4, 6, 8 и 10 мин из реакционной смеси отбирали аликвоты по 40 мкл и переносили в пробирки с 200 мкл 5% уксусной кислоты для остановки реакции. Затем измеряли оптическую плотность при 405 нм. Вычисляли скорость расщепления субстрата, используя величину молярной экстинкции паранитроанилина, равную 9600 при 405 нм.

Результаты

Исследование фармакокинетики пуролазы при субтерапевтических дозах фермента выполнены для двух групп кроликов. Животным первой группы («наивные» кролики) до введения пуролазы тромболитик не вводился. Кроликов второй группы ранее использовали для изучения токсикокинетики препарата мини-плазминогена. На них проведен полный цикл токсикокинетических исследований, для чего животные ежедневно получали 10-кратную терапевтическую дозу мини-плазминогена (10 мг на 1 кг веса кролика) в течение двух недель. Кролики благополучно перенесли испытание без каких-либо осложнений. Через 6 недель после завершения токсикокинетических экспериментов они достигли 4,5 кг средней массы, и на них был повторен фармакокинетический эксперимент с невысокими дозами урокиназы. Полученные данные представлены на рис. 1 и 2.

Рис. 1. Кинетика инактивации урокиназы (uPA).

а — группа «наивных» кроликов; б — группа кроликов после токсикокинетики. В легендах диаграмм приведены дозы урокиназы, введенные кроликам, и уравнения, описывающие полученные результаты. Контрольные образцы крови, взятые до введения урокиназы, для всех кривых показывали активность ниже 0,0005 нКат/мл.

Рис. 2. Зависимость MRT от дозы пуролазы. Группа «наивных» кроликов.

Основные различия в фармакокинетике урокиназы в «наивных» кроликах и кроликах, ранее использованных для изучения токсикокинетики препарата мини-плазминогена, видны при сравнении рис. 1, а, б. Кривые для кроликов первой группы в экспоненциальном по времени представлении в диапазоне доз от 0,05 до 0,2 мг/кг (10—40% терапевтической дозы при тромболитической терапии) практически параллельны друг другу. МRТ составляет 4,2±0,2 мин, которое далее растет до 9 мин при терапевтической дозе (рис. 2).

Объем распределения равен примерно 70 мл/кг во всем диапазоне доз, что близко к объему крови, а не плазмы. Соответственно биодоступность в плазме составляет 60% (рис. 3). Кролики, имевшие в анамнезе токсикокинетический эксперимент с мини-плазмином в диапазоне доз от 0,05 до 0,2 мг/кг, контрастно демонстрируют сильную зависимость скорости инактивации от дозы. Кривые экспонент ферментативной активности пуролазы от времени расходятся веером от одной точки (см. рис. 1, б), демонстрируя практически линейную зависимость МRТ от дозы.

Рис. 3. Биодоступность урокиназы в плазме. Группа «наивных» кроликов.

В диапазоне доз от 50 до 100% терапевтической дозы величины МRТ у обоих групп кроликов уравниваются. Биодоступность и объем распределения также выходят на 60% и 70 мл/кг (рис. 4) величины, характерные для «наивных» кроликов во всем диапазоне использованных доз (см. рис. 3). Расходящиеся веером кинетические кривые (см. рис. 1, б) и превышающая стандартные 60% значения биодоступности (см. рис. 4) при вводимой дозе урокиназы ниже 0,2 мг/кг, могли бы быть интерпретированы как результат накопления кроличьей проурокиназы в кровеносной системе животного в ответ на плазминовый шок при токсикокинетическом эксперименте. Однако контрольные пробы плазмы крови, отобранной до введения урокиназы кроликам не показывали присутствия измеримых концентраций урокиназы.

Рис. 4. Зависимость MRT и биодоступности от дозы пуролазы. Группа кроликов после токсикокинетики.

Заключение

Токсикокинетические исследования предназначены для выявления токсичности, обусловленной многократным повторением применения лекарственного средства, главным образом из-за накопления неполностью выведенного из организма лекарственного средства или продуктов его метаболизма. Мы не обнаружили никаких изменений в фармакокинетике плазмина его основного ингибитора и активатора при токсикокинетическом исследовании препарата миниплазминогена. Так как фармакокинетика урокиназы при субтерапевтических дозах нелинейна [12], а механизм нелинейности неясен, мы решили посмотреть на возможное необратимое изменение фармакокинетики урокиназы в результате двухнедельного ежедневного введения 10-кратной терапевтической дозы миниплазмина.

Описываемые в нашей статье особенности фармакокинетики урокиназы при низких концентрациях фермента, вероятно, связаны с предысторией (анамнезом) экспериментальных животных. Сама по себе 10-кратная терапевтическая доза плазмина (10 мг/кг веса кролика, 2500 нМ в плазме при 60% биодоступности) не намного превосходит природную концентрацию плазминогена в плазме (1500—2000 нМ) и не является шоковой в отличие от активаторов плазминогена, концентрация которых при тромболитической терапии в сотни раз превышает их нормальную концентрацию в плазме. Современные тенденции [1, 2, 4, 5] единовременного использования обоих естественных активаторов плазминогена (tPA и uPA) при одновременном снижении терапевтической дозы каждого обусловливает актуальность исследований особенностей фармакокинетики плазмина в области доз от 0,05 до 0,3 мг/кг. Дополнительные данные требуются для ответа на вопрос: какой из множества потенциальных ингибиторов урокиназы обеспечивает повышенную чувствительность к урокиназе и какие области в структуре белка урокиназы ответственны за особенности ее фармакокинетики. Мы продолжаем эти исследования.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии источника финансирования.

Funding source. The authors declare no source of financing.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.