Инфаркт миокарда (ИМ) — одно из наиболее распространенных проявлений старения сердечно-сосудистой системы, нередко заканчивающееся летальным исходом. Это обстоятельство обусловливает важность совершенствования методов оценки коронарного риска.
С каждым годом артериальная стенка накапливает все больше патологических изменений, затрагивающих атеросклеротическое поражение сосудов и их структурные изменения [1]. А потому неудивительно, что базовым параметром, используемым для комплексной оценки риска фатального сердечно-сосудистого события, является возраст [2]. Ранее мы продемонстрировали перспективы применения возраст-зависимого подхода к оценке риска возникновения ИМ на основании анализа аллельного полиморфизма генов, вовлеченных в формирование предрасположенности к этому полигенному заболеванию [3]. Предложенный подход [3] позволяет дополнить результаты исследований, полученных методом «случай-контроль», и нуждается в меньшем числе допущений, чем последний, причем все они могут быть проверены экспериментально. В цитируемой работе обнаружена связь с возрастом дебюта ИМ полиморфных вариантов генов IFNG, PAI-1, IL10, TGFB1 и MIR196A2.
Настоящее исследование направлено на поиск других ассоциированных с возрастом дебюта ИМ генов. Мы расширили панель исследуемых генов и проанализировали связь с возрастом дебюта ИМ полиморфных вариантов следующих генов-кандидатов: PTEN, AKT1, TP53, PIK3CA, VEGFA, CDKN2B-AS1, AGTR1 и MIR126. Выбор большинства из перечисленных генов основан на результатах наших предшествующих исследований. Мы показали, что гены PTEN, AKT1, TP53, PIK3CA, VEGFA занимают ключевые позиции в регуляторной сети сигнальных путей ИМ-ассоциированной микроРНК-375 [4]. Известно также, что эти гены участвуют в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, сопутствующих ИМ [5—7]. Ген CDKN2B-AS1 (ANRIL) находится в локусе 9p21.3, ассоциация которого с ишемической болезнью сердца и/или ИМ показана в ряде исследований, в том числе и нами [8—10]; этот ген кодирует длинную некодирующую РНК, которая может участвовать в регуляции уровней микроРНК [11], в том числе ИМ-ассоциированных [12]. Ассоциация полиморфных вариантов генов AGTR1 и MIR126 с ИМ также показана в исследованиях, выполненных с использованием подхода «случай-контроль» [13, 14], поэтому мы включили их в рассмотрение как перспективные для анализа их связи с возрастом дебюта ИМ.
Цель исследования — оценить связь возраста дебюта ИМ с носительством полиморфных вариантов генов PTEN (rs701848), AKT1 (rs2494731), TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs6443624), VEGFA (rs3025039), CDKN2B-AS1 (rs518394 и rs564398), AGTR1 (rs5186) и MIR126 (rs4636297).
Материал и методы
Для ретроспективного исследования использованы образцы из составленной ранее коллекции геномной ДНК из периферической крови 289 пациентов, этнических русских (по самоопределению). В выборку вошли 193 мужчины (средний возраст первого ИМ 52,2±11,5 года) и 96 женщин (средний возраст первого ИМ 59,2±9,7 года). Все пациенты получали лечение в отделе неотложной кардиологии Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России в период с 2004 по 2015 г. Диагноз устанавливали на основании определения динамики маркеров повреждения миокарда: тропонина I или T, креатинфосфокиназы и ее кардиоспецифичного изофермента МВ (в «дотропониновую эру») в сочетании с хотя бы одним из следующих признаков: 1) приступ боли продолжительностью более 20 мин; 2) изменения на ЭКГ: а) для Q-ИМ — элевация сегмента ST в двух соседних отведениях на уровне точки J на 0,2 мВ (2 мм) и более для мужчин и 0,15 мВ (1,5 мм) и более для женщин в отведениях V2—V3 и на 0,1 мВ (1 мм) и более в отведениях I, II, III, aVL, aVF, V4—V6), образование патологического зубца Q: любой в отведениях V1—V3 и продолжительностью 0,03 с и более в отведениях I, II, III, aVL, aVF, V4—V6; б) для не Q-ИМ — горизонтальная и косонисходящая депрессия сегмента ST на 0,1 мВ (1 мм) и более, косовосходящая депрессия на 0,2 мВ (2 мм) и более, инверсия зубца T больше 1 мм в отведениях I, II, III, aVL, aVF, V1—V6; 3) вновь появившиеся нарушения локальной сократимости или жизнеспособности миокарда, выявленные одной из визуализирующих методик; 4) идентификация коронарного тромба на ангиографии или аутопсии. От пациентов получено информированное согласие на проведение исследования.
Генотипирование. Определение носительства полиморфных вариантов генов PTEN (rs701848), AKT1 (rs2494731), TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs6443624), VEGFA (rs3025039), CDKN2B-AS1 (rs518394 и rs564398), AGTR1 (rs5186) и MIR126 (rs4636297) осуществляли с помощью зондов TaqMan SNP Genotyping Assay и системы полимеразной цепной реакции в реальном времени StepOne. Для подтверждения правильности анализа производили повторное генотипирование случайно выбранных проб в количестве 10% от исходной выборки.
Статистическая обработка данных. Поиск генетических вариантов, носительство которых ассоциировано с возрастом дебюта ИМ, осуществляли посредством сравнения функций выживаемости Каплана-Майера, рассчитывая отношение рисков (hazard ratio, HR) дебюта ИМ и его 95% доверительный интервал (confidence interval, 95% CI) у групп носителей альтернативных аллелей или генотипов в модели пропорциональных рисков Кокса. Для целей настоящего исследования отсчет времени при построении кривых выживаемости вели со дня рождения пациента, а в качестве конечной точки принимали первый случай ИМ.
Статистическую обработку данных проводили при помощи средств языка программирования R. Исследование функций выживаемости, включая проверку пропорциональности рисков при помощи теста остатков Шенфильда, проводили с использованием пакета «survival» в соответствии с документацией [15]. Построение регрессионной модели для предсказания возраста ИМ осуществляли при помощи библиотеки scikit-learn для языка Python 3. Для отбора наиболее важных признаков использовали Lasso-регрессию с регуляризацией по L1-норме [16]. Подбор величины штрафа осуществляли прямым перебором, реализованным в классе sklearn.linear_model. LassoCV() по сетке параметров с 10-кратной кросс-валидацией для повышения устойчивости модели и снижения вероятности переобучения. Разбиение выборки на обучающую и тестовую проводили в пропорции 4:1 соответственно, используя функцию train_test_split() той же библиотеки.
Результаты
Перед исследованием ассоциации полиморфных вариантов генов PTEN (rs701848), AKT1 (rs2494731), TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs6443624), VEGFA (rs3025039), CDKN2B-AS1 (rs518394 и rs564398), AGTR1 (rs5186) и MIR126 (rs4636297) с ИМ мы определили частоты их аллелей и генотипов, а также оценили соблюдение равновесия Харди-Вайнберга. Отклонения наблюдаемых частот генотипов выявлены для rs5186*C (ген AGTR1) (p=1,7×10–5) и rs3025039 (ген VEGFA) (p=0,0061). Для всех девяти SNP наблюдалась высокая частота минорного аллеля, лежащая в диапазоне от 0,15 до 0,47, которая существенно не отличалась от частоты минорного аллеля, представленной для европейской популяции в базе данных dbSNP (табл. 1).
Таблица 1. Локализация исследуемых полиморфных участков и частота минорных аллелей (MAF), наблюдаемая у этнических русских с инфарктом миокарда, в сравнении с данными для европейцев из базы данных dbSNP NCBI
| SNP rs, минорный аллель | Ген* | Хромосомная локализация* | MAF (русские)** | MAF (европеоиды)*** |
| rs5186*C | AGTR1 (angiotensin II receptor type 1) | 3q24 | 0,23 | 0,30 |
| rs6443624*A | PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) | 3q26.32 | 0,15 | 0,23 |
| rs3025039*T | VEGFA (vascular endothelial growth factor A) | 6p21.1 | 0,21 | 0,14 |
| rs564398*C | CDKN2B-AS1 (CDKN2B antisense RNA 1) | 9p21.3 | 0,44 | 0,40 |
| rs518394*С | CDKN2B-AS1 (CDKN2B antisense RNA 1) (другое название гена — ANRIL) | 9p21.3 | 0,40 | 0,44 |
| rs4636297*A | MIR126 (microRNA 126) | 9q34.3 | 0,36 | 0,37 |
| rs701848*C | PTEN (phosphatase and tensin homolog) | 10q23.31 | 0,47 | 0,39 |
| rs2494731*C | AKT1 (AKT serine/threonine kinase 1) | 14q32.33 | 0,36 | 0,32 |
| rs1042522*G | TP53 (tumor protein p53) | 17p13.1 | 0,33 | 0,28 |
Примечание. MAF — частота минорных аллелей; * — в соответствии с HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee); ** — данные настоящего исследования; *** — в соответствии с базой данных dbSNP NCBI.
Анализ кривых выживаемости проводили для больных ИМ, носителей минорных аллелей этих генов (в форме как гомозиготы, так и гетерозиготы) в сравнении с гомозиготами по мажорному аллелю в соответствии с доминантной моделью наследования. Наблюдали статистически значимую ассоциацию возраста дебюта ИМ с носительством вариантов rs5186 гена AGTR1, rs6443624 гена PIK3CA и rs518394 гена CDKN2B-AS1 (p<0,05). На рисунке представлено смещение кривых выживаемости у носителей альтернативных вариантов этих генов. Для остальных 6 исследованных полиморфных участков статистически значимых различий в возрасте дебюта ИМ при носительстве альтернативных генетических вариантов не наблюдали. Проверка условия пропорциональности рисков при помощи теста остатков Шенфельда показала, что оценки отношения рисков (HR) для представленных на рисунке вариантов генов постоянны и статистически значимо не зависят от возраста индивидов (p<0,05).
Рис. Кривые Каплана-Майера для возраста дебюта инфаркта миокарда у носителей альтернативных полиморфных вариантов rs5186 гена AGTR1, rs6443624 гена PIK3CA и rs518394 гена CDKN2B-AS1 (представлены данные только для значимых ассоциаций).
Минорные аллели, помеченные звездочкой, присутствуют у больных инфарктом миокарда в гомо- или гетерозиготной форме. Кривые для носителей аллелей, повышающих риск раннего инфаркта миокарда, выделены красным цветом, а для носителей протективных генотипов — зеленым. ИМ — инфаркт миокарда.
В табл. 2 приведены значения p и HR (95% CI) для аллелей риска AGTR1, PIK3CA и CDKN2B, носительство которых (как в гомо-, так и в гетерозиготной форме) статистически значимо снижает возраст дебюта ИМ. Во всех случаях аллелем риска оказался минорный аллель. Наибольший уровень значимости ассоциации с ранним возрастом первого ИМ наблюдался для носительства аллеля rs518394*C гена CDKN2B-AS1 (p=0,000038). Значения HR для всех обнаруженных аллелей риска лежат в довольно узком диапазоне от 1,42 до 1,70, 95% ДИ не пересекает 1.
Таблица 2. Минорные аллели генов, носительство которых статистически значимо ассоциировано с более ранним возрастом дебюта инфаркта миокарда
| Ген, rs | Аллель риска (сумма гомо- и гетерозиготных генотипов) | Величина p | HR (95% CI) | Величина смещения возраста ИМ (лет) |
| AGTR1, rs5186 | C | 0,023 | 1,43 (1,12—1,74) | 3,5 |
| PIK3CA, rs6443624 | A | 0,01 | 1,42 (1,17—1,67) | 3,18 |
| CDKN2B-AS1, rs518394 | C | 0,000038 | 1,70 (1,47—11,93) | 8,22 |
Примечание. rs — идентификационный номер полиморфизма; HR (95% CI) — отношение рисков (95% доверительный интервал); ИМ — инфаркт миокарда.
Для оценки числа лет, на которые смещается возраст дебюта ИМ в зависимости от генотипа индивида, мы обучали модель линейной регрессии, минимизируя квадратичную функцию потерь с введением штрафа по L1-норме для прореживания признакового пространства полиморфных вариантов. В результате получены оценки смещения возраста дебюта ИМ в сторону более раннего его развития на 3,5 года для носителей rs5186*C гена AGTR1, 3,18 года для носителей rs6443624*A гена PIK3CA и 8,22 года для носителей rs518394*C гена CDKN2B-AS1 (см. табл. 2).
Таким образом, совокупность представленных результатов свидетельствует об ассоциации вариантов генов AGTR1, PIK3CA и CDKN2B-AS1 с возрастом дебюта ИМ.
Обсуждение
В настоящей работе исследована ассоциация полиморфных вариантов генов PTEN (rs701848), AKT1 (rs2494731), TP53 (rs1042522), PIK3CA (rs6443624), VEGFA (rs3025039), CDKN2B-AS1 (rs518394 и rs564398), AGTR1 (rs5186) и MIR126 (rs4636297) с возрастом дебюта ИМ. Выявлены ассоциированные с возрастом дебюта ИМ аллели риска генов AGTR1, PIK3CA и CDKN2B-AS1, носительство которых способствует его развитию на 3—8 лет раньше по сравнению с носителями альтернативных генотипов.
Полученные результаты хорошо укладываются в современные представления о роли продуктов генов AGTR1, PIK3CA и CDKN2B-AS1 в функционировании сердечно-сосудистой системы и показывают их значение для оценки коронарного риска в российской популяции.
Белковым продуктом гена AGTR1 является рецептор ангиотензина II типа 1, вовлеченный в ренин-ангиотензин-альдостероновую систему регуляции уровня кровяного давления и объема крови в организме [17]. Активация рецептора ангиотензина II инициирует сокращение сосудов и выработку альдостерона, приводящую, в свою очередь, к изменению солевого баланса и повышению уровня артериального давления. Уже более 20 лет известно, что носительство аллеля C*rs5186 гена AGTR1 — аллеля, который, по нашим данным, связан с более ранним дебютом ИМ, — ассоциировано с повышенным уровнем артериального давления и большей жесткостью стенки аорты [17]. Показано также, что носительство генотипа CC rs5186 гена AGTR1 ассоциировано с повышенной концентрацией липопротеидов низкой плотности и триацилглицеридов [18], что традиционно рассматривается как фактор сердечно-сосудистого риска [19]. Избыточная экспрессия гена AGTR1 ассоциирована с гипертрофией миокарда [20].
Ген PIK3CA кодирует каталитическую субъединицу A фосфатидилинозитол-3-киназы (фосфоинозитид-3-киназы) — фермента, который участвует во множестве метаболических путей и контролирует ключевые функции клеток, такие как рост, выживаемость, устойчивость к повреждающим воздействиям. Фосфатидилинозитол-3-киназа является ключевым элементом сигнального пути PI3K/AKT, связанного с регуляцией работы Na+, K+, Ca2+ -активируемых ионных каналов в кардиомиоцитах и регуляцией сердечного ритма; фармакологическая блокировка работы этого пути может приводить к синдрому удлиненного QT-зубца [21]. Активация сигнального пути PI3K/AKT способствует выживанию кардиомиоцитов в условиях ишемии [22]. Ген PIK3CA принадлежит к мишеням микроРНК-375 и идентифицирован нами ранее как один из ключевых узлов в сети сигнальных путей, регулируемой этой микроРНК и вовлеченной в развитие ИМ [4].
Ген CDKN2B-AS1 (ANRIL) кодирует длинную некодирующую антисмысловую РНК ANRIL (Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus), вовлеченную в регуляцию экспрессии циклин-зависимых киназ, критически важных элементов системы регуляции клеточного цикла [23]. Экспрессия этой РНК в мононуклеарных клетках периферической крови коррелирует с тяжестью атеросклеротического поражения сосудов пациента [24], а снижение ее циркуляции может предотвратить коронарный атеросклероз за счет снижения апоптоза эндотелиальных клеток сосудов и экспрессии факторов воспаления [25]. Исследования показывают влияние ANRIL на процесс ангиогенеза, опосредованный контролем уровня экспрессии белкового продукта гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF [26]. ANRIL регулирует также фосфорилирование серин/треонин-протеинкиназы Akt, что способствует ангиогенезу и улучшает сердечную функцию у мышей после ИМ [27].
Заключение
Инфаркт миокарда относится к возраст-зависимым заболеваниям, и поскольку индивидуальные генетические вариации задают начальный уровень риска развития таких заболеваний, генетическую предрасположенность к ним можно оценивать по времени до наступления события (time-to-event (survival) data analysis) [28]. Такой подход широко используется при прогнозировании риска сердечно-сосудистых событий в зависимости от различных негенетических неблагоприятных факторов с помощью прогностических шкал (шкала SCORE [29], Фрамингемская шкала [19] и другие). Полученные нами результаты показывают наиболее значимые генетические маркеры риска, которые могут быть использованы в будущем для совершенствования таких шкал.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований №19-315-80019.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.