de SabletThibaut

Piazuelo M.B.

Shaffer C.L.

Schneider B.G.

Asim M.

Chaturvedi R.

Bravo L.E.

Sicinschi L.A.

Delgado A.G.

Mera R.M.

Israel D.A.

Romero-Gallo J.

Peek R.M.Jr.

Cover T.L.

Correa P.

Wilson K.T.

Роль филогеографического происхождения Helicobacter pylori в развитии рака желудка

Журнал: Доказательная гастроэнтерология. 2012;(1): 37-45

Просмотров : 21

Загрузок : 1

Как цитировать

de Sablet Thibaut, Piazuelo M. B., Shaffer C. L., Schneider B. G., Asim M., Chaturvedi R., Bravo L. E., Sicinschi L. A., Delgado A. G., Mera R. M., Israel D. A., Romero-Gallo J., Peek R.M. Jr., Cover T. L., Correa P., Wilson K. T. Роль филогеографического происхождения Helicobacter pylori в развитии рака желудка. Доказательная гастроэнтерология. 2012;(1):37-45.

Авторы:

de SabletThibaut

Все авторы (16)

Значимость данного исследования

Что известно по данной проблеме?

- Инфекция Helicobacter pylori является основной причиной появления пептической язвы и рака желудка (РЖ).

- Высокая распространенность H. pylori в целом коррелирует с повышенным риском развития РЖ, однако на земле есть регионы, где заболеваемость РЖ относительно невысока, несмотря на высокую распространенность

H. pylori.

- Штаммы H. pylori с факторами вирулентности cagA+ и vacA s1m1 чаще всего ассоциируются с риском развития РЖ.

- Риск развития РЖ у жителей горных районов Анд в Колумбии в 25 раз выше, чем среди населения прибрежных районов страны.

Каковы новые данные?

- Штаммы H. pylori, инфицирующие жителей горных районов Колумбии, имеют исключительно европейское происхождение.

- В прибрежных районах встречаются штаммы

H. pylori как европейского, так и африканского филогеографического происхождения, причем последние преобладают.

- Европейское филогеографическое происхождение H. pylori достоверно ассоциируется с наиболее выраженными гистологическими изменениями и повышенной частотой повреждения ДНК в эпителиальных клетках желудка независимо от места проживания инфицированных людей: в горных районах с высоким риском развития РЖ или в прибрежных районах с низким риском развития РЖ.

Какое значение это может иметь для клинической практики в обозримом будущем?

- Мы установили, что филогеографическое происхождение штаммов H. pylori является достоверным прогностическим фактором развития РЖ.

- Таким образом, определение филогеографического происхождения инфицирующих штаммов H. pylori можно использовать для оценки степени риска развития РЖ и планирования соответствующих медицинских мероприятий, включая интенсификацию программ эрадикационной терапии и эндоскопического наблюдения.

Введение

Helicobacter pylori - бактерия, инфицирующая 50% населения земного шара, является причиной развития язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, а также рака желудка (РЖ) [1, 2]; ее относят к канцерогенам 1-го порядка [3]. Поражения, предшествующие формированию РЖ, являются результатом последовательности событий от хронического активного неатрофического гастрита до мультифокального атрофического гастрита, кишечной метаплазии (КМ) и дисплазии [4, 5]. Исход инфекции определяется свойствами возбудителя в сочетании с характеристиками его хозяина и условий окружающей среды [6]. К примеру, выявлена связь между генотипами cagA+ и vacA s1m1 и риском возникновения РЖ, которая в наибольшей степени выражена в некоторых популяциях на фоне полиморфизмов отдельных генов хозяев H. pylori [7-9]. Важным признаком инфекции служит окислительное повреждение ДНК в эпителиальных клетках желудка, индуцирующее процесс канцерогенеза [10, 11]. В некоторых регионах земного шара заболеваемость РЖ коррелирует с распространенностью H. pylori, хотя эта взаимосвязь отмечается не всегда [12]. Описана так называемая африканская загадка, т.е. почти стопроцентное носительство H. pylori среди населения Африки на фоне низкой заболеваемости язвенной болезнью и РЖ [13]. В Латинской Америке выявлены значительные географические различия по заболеваемости РЖ, несмотря на одинаково высокую распространенность H. pylori в отдельных районах [14]. Такая ситуация отмечается в Колумбии, где население высокогорных районов штата Нариньо характеризуется очень высокой заболеваемостью РЖ (почти 150 случаев на 100 000 населения в год по сравнению с 6 на 100 000 на тихоокеанском побережье), хотя оба района расположены на расстоянии всего 200 км один от другого [15, 16]. Более того, распространенность прогрессирующих предраковых поражений в слизистой оболочке (СО) желудка у жителей колумбийских Анд выше, чем в прибрежных районах [17].

Жители горных районов с высоким риском развития РЖ и прибрежной области с низким риском развития рака резко различаются по этническим характеристикам. Первые - в основном «метисы», которые являются потомками американских индейцев с небольшой примесью европейской крови, тогда как население прибрежных районов состоит главным образом из «мулатов» смешанного европейско-африканского происхождения [18]. Хотя канцерогенез желудка связывают с видовой и штаммовой изменчивостью генетического материала H. pylori [7-9], распространенность штаммов cagA+vacA s1m1 в области низкого риска (НР) развития РЖ в Колумбии лишь ненамного (13%) меньше, чем в области высокого риска (ВР) развития РЖ [17]. Этим различием штаммовых характеристик нельзя объяснить 25-кратное различие по заболеваемости раком. Поэтому мы предположили, что существуют другие бактериальные факторы, определяющие риск развития РЖ. Для того чтобы выяснить, имеются ли радикальные различия изолятов H. pylori из географических областей с низким и высоким риском развития РЖ, мы проанализировали наследственные гаплотипы соответствующих штаммов.

Материалы и методы

Пациенты. В течение 2006 г. в исследование последовательно отбирали мужчин в возрасте от 39 до 60 лет - пациентов двух муниципальных больниц, расположенных в двух различающихся степенью риска развития РЖ районах штата Нариньо, Колумбия. У всех этих пациентов имелись симптомы диспепсии и все они подвергались эндоскопическому исследованию верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Отбор мужчин для исследования был обусловлен тем, что в Колумбии, как и во всем мире, частота развития РЖ у них в 2 раза выше, чем у женщин (http://globocan.iarc.fr); предшествующие исследования показали, что такое различие существует и в штате Нариньо [19]. В состав горного андского района (области ВР) входит город Тукеррес, а в прибрежной области НР находится город Тумако. Жители прибрежного района относятся к этнической группе мулатов, а жители горного района - к группе метисов [18, 20, 21]. Данные о характере питания представителей обеих групп опубликованы ранее [20] (учитывался также такой фактор, как курение в период проведения исследования). В число критериев исключения из исследования входили ранее перенесенная

гастрэктомия, наличие выраженного хронического заболевания и использование любого из перечисленных лекарственных средств менее чем за 4 нед до эндоскопии: блокаторов Н2 гистаминовых рецепторов, ингибиторов протонного насоса или антибиотиков. В обеих областях эндоскопию проводил один и тот же опытный гастроэнтеролог. Биоптаты СО из антрального отдела, угла и тела желудка, полученные при биопсии, заливали в парафин для последующего гистологического анализа. Два дополнительных биоптата - один из антрального отдела, а другой из тела желудка - сразу после взятия замораживали с глицерином и тиогликолятом, а потом использовали для культивирования H. pylori. Пробы транспортировали в сухом льду в Университет Вандербилта (Нэшвил, штат Теннесси, США) для проведения анализов.

H. pylori были выделены от 81 из 89 пациентов, включенных в исследование. Из них 42 (51,8%) человека проживали в г. Тукеррес, расположенном в Андах, где высок риск развития РЖ, а 39 (48,7%) - в г. Тумако на тихоокеанском побережье с низким риском этого заболевания [15, 16]. Патоморфологи, которые анализировали биоптаты, не знали о том, у жителя какого географического района получен материал; генотип и филогенетическое происхождение штаммов H. рylori также были скрыты от этих исследователей. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании.

Выделение и культивирование штаммов H. pylori

Биоптаты, взятые из антрального отдела и тела желудка, гомогенизировали в стерильных условиях в 100 мкл фосфатного буфера (ФБР, рН 7,4), используя гомогенизатор Kimble-Kontes (Vineland, NJ, США). Гомогенаты наслаивали на триптиказный соевый агар (TSA), содержащий 5% овечью кровь, с добавлением ванкомицина

(20 мг/л), бацитрацина (200 мг/л), налидиксовой кислоты (10 мг/л) и амфотерицина В (2 мг/л) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США). 1:10 разведения сеяли на пластинки TSA (BBL, LABSCO) в отсутствие антибиотиков. Агаровые пластинки инкубировали в микроаэробных условиях (6% О2, 6% CO2 и 88% N2; Campy Pak Plus envelope, BBL) при температуре 37 °С в течение 4-8 дней до появления мелких прозрачных колоний серого цвета. Для подтверждения принадлежности бактерий к виду H. pylori использовали окрашивание по Граму, уреазный и оксидазный тесты. Колонии имели характерные для H. pylori форму и морфологическое строение. Для экстракции ДНК использовали мазки и одиночные колонии.

Экстракция и генотипирование ДНК H. pylori

ДНК экстрагировали из бактериальных бляшек реагентами Gentra Puregene в соответствии с указаниями изготовителя (Oiagen Valencia, CA, США). Количественное определение ДНК для каждого штамма проводили спектрофотометрическим методом. В качестве праймеров для амплификации 30x27;-области гена cagA использовали CАG1 и CAG2 [22], генерируя фрагменты длиной от 591 до 856 пар оснований. Для амплификации областей s гена vacA использовали праймeры VA1F и VF1R, что давало фрагменты длиной 259 пар оснований для вариантов типа s1 и фрагменты длиной 286 пар оснований для вариантов типа s2 [23]. Для определения области m гена vacA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали смесь 4 прямых праймеров (MF 1.1, MF 1.2, MF 1.3, MF 1.4) и один обратный праймер MR1. Таким образом достигалась амплификация фрагментов длиной 107 пар оснований для штаммов m1 и 182 пары оснований для штаммов m2 [24].

Гистологическое исследование

Общую оценку гистологических изменений у каждого пациента давали независимо два патоморфолога. На основании анализа всех биоптатов СО из антрального отдела, тела и угла желудка в соответствии с требованиями модифицированной Сиднейской классификации гастрита (оценивали степень воспаления, атрофии и КМ с использованием рекомендуемых визуально-аналоговых шкал) [25] и Падуанской международной классификации дисплазий [26]. Общие результаты анализа оценивали по 6-балльной порядковой шкале следующим образом:

1 балл - слабый до умеренного неатрофический гастрит, 2 - тяжелый неатрофический гастрит, 3 - мультифокальный атрофический гастрит без КМ, 4 - кишечная матаплазия, 5 - дисплазия и 6 - карцинома. При наличии только неатрофического гастрита оценку производили на основании характера воспаления (острое или хроническое).

В дополнение мы использовали детальную балльную систему гистопатологической оценки с целью количественной характеристики морфологических параметров для каждой категории общего диагноза, которая, как было показано, является чувствительной и надежной системой для длительного динамического наблюдения пациентов, получавших лечение по поводу инфекции H. pylori [27]. Согласно этой системе тяжесть атрофических изменений без метаплазии, степень и тип (соотношение полных и неполных типов) КМ, а также тяжесть диспластических изменений характеризуются определенными численными значениями. Мы использовали эту систему, поскольку степень тяжести атрофии СО желудка ассоциируется с увеличением риска развития рака [28]; при неполной КМ риск развития РЖ выше, чем при полной КМ [29, 30], а гистологическая степень дисплазии коррелирует с риском развития РЖ [26]. Оценку мультифокального атрофического гастрита (МАГ) по 3-балльной шкале модифицировали, добавляя следующие показатели: неопределенная атрофия (0,25), легкий (0,50), умеренно-тяжелый (0,75) и тяжелый (1,0) гастрит. Оценку КМ по 4-балльной шкале также модифицировали, проводя ее с учетом типа и степени поражения. Были выделены 4 разных типа: полный тип (0,1), смешанный доминирующий полный тип (0,2), смешанный доминирующий неполный тип (0,3) и неполный (толстокишечный) тип (0,4). Для идентификации типа КМ проводили окрашивание с использованием реактива Шиффа и альцианового синего, а также высоко-железного диамина и альцианового синего [27]. Для оценки степени КМ каждый биоптат характеризовали с учетом площади гистологического среза, содержавшего КМ, используя 3-балльную шкалу, следующим образом: <30%, от 30 до 60% и >60%. Среднюю степень КМ (рассчитанную от общего количества биоптатов на пациента) группировали по терцилям. Каждому терцилю присваивали следующие значения: 0,2, 0,4 или 0,6. Для получения полной оценки КМ значения ее типа и степени прибавляли к исходному баллу по 4-балльной системе. Оценку дисплазии по 5-балльной шкале модифицировали, добавляя следующие показатели: неопределенная дисплазия (0,25), дисплазия низкой (0,50) и высокой (0,75) степени. При статистическом анализе полученных данных использовали эти модифицированные показатели, а не стандартные общие гистопатологические оценки.

Для подтверждения данных, полученных при исследовании гистологических срезов, мы использовали в качестве альтернативного метода международную систему классификации гастритов Operative Link for Gastritis Assessment (OLGA) [31]. В ней применяются соответствующие балльные оценки модифицированной сиднейской системы для антрального отдела и тела желудка, а пациенты подразделяются по стадиям атрофического гастрита (от 0 до 4) на основании степени и тяжести заболевания (с метаплазией или без нее).

Окрашивание 8-гидрокси-2×-дезоксигуанозином

Срезы полученных при биопсии тканей с наиболее выраженными гистологическими изменениями от каждого пациента отбирали для окрашивания 8-гидрокси-2×;-дезоксигуанозином (8-OHdC). Залитую в парафин ткань депарафинировали, демаскировку антигена проводили, как описано в работе [18]. Срезы инкубировали с мышиными моноклональными антителами к 8-OHdC в разведении 1:4000 (Abcam, Cambridge, MA, США) в течение ночи при комнатной температуре. После отмывания продолжали инкубацию с биотинилированными вторичными антителами в разведении 1:1000 на протяжении 30 мин. Затем срезы промывали и инкубировали в присутствии пероксидазы хрена, конъюгированной со стрептавидином (Biocare Medical, Concord, CA, США), в течение 30 мин.

В качестве хромогена использовали диаминобензидин (Sigma-Aldrich), окрашивание ткани производили гематоксилином [18]. Окрашивание 8-OHdC количественно оценивалось патоморфологом, не знавшим источника пробы, по количеству положительных эпителиальных ядер на 100 клеток в каждой из поверхностных, промежуточных и глубоких областей желез по 300-балльной шкале (от 0 до 300); полученные результаты выражали в процентах от общего числа положительных ядер.

Типирование мультилокусных последовательностей

Фрагменты 7 несцепленных генов «домашнего хозяйства» (atpA, urel, ppa, mutY yphC) длиной от 398 до 627 пар оснований из каждого колумбийского штамма H. pylori амплифицировали в ПЦР с использованием высокоточной Taq-полимеразы (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и секвенировали обе их нити [32-34]. Дополнительно из базы данных MLST (http://pubmlst.org/helicobacter) извлекали соответствующие последовательности 380 изолятов H. pylori широко распространенных по всему миру, которые ранее были отнесены к одной из 7 анцестральных гаплогрупп H. pylori [34]. Конкатенированные нуклеотидые последовательности выравнивались программой MUSCLE [35]. Филогенетический анализ проводили с помощью программы MEGA4 [36], используя двухпараметрическую модель Кimura для замены нуклеотидов и кластеризацию методом присоединения соседа; все участки, содержавшие разрывы, изымали из окончательного набора данных, включавшего 3401 позицию. Ветви филогенетического древа, соответствующие последовательностям, которые повторялись менее чем в 50% бутстреп-реплик, коллапсировали. Бутстреп-значения внутренних ветвей были достоверно высокими, что свидетельствовало о корректной топологии ветвей в пределах кладов. Филогенетические деревья вычерчивали в масштабе с длиной ветвей, соответствовавшей эволюционным расстояниям, которые использовали для построения древа.

Статистический анализ

Для анализа филогенетических распределений использовали точный критерий Фишера, а для анализа

гистопатологических оценок и окрашивания 8-OHdG тестировали данные на нормальность. Ввиду их нормального распределения строили генерализованную многофакторную линейную модель с гауссовой цепью; ее использовали для анализа зависимых переменных в оценках гистопатологических изменений и повреждения ДНК на основании независимых переменных из базы данных MLST и географических областей риска, после поправки на возраст. При сопоставлении данных приводятся средние величины ±95% доверительный интервал (ДИ) с соответствующими значениями р. Для всех расчетов использовали компьютерную программу STATA 11 software (StataCorp LP).

Результаты

Колумбийские штаммы H. pylori подразделяются на две филогенетические группы.

Для анализа филогеографического происхождения

H. pylori использовали базу данных MLST, основанную на анализе последовательностей генов «домашнего хозяйства» и ранее использовавшуюся для оценки филогенетических взаимосвязей между штаммами H. pylori из различных районов земного шара [32-34]. Исследование включало в общей сложности 89 сопоставимых по возрасту взрослых мужчин, в том числе 44 из области НР и 45 из области ВР (дополнительная таблица S1). H. pylori были обнаружены при культивировании биоптатов желудка у 81 из 89 человек. По данным генотипического анализа, 64 из 81 изолята содержали штаммы cagA+ и vacA s1m1 - два фактора вирулентности, тесно ассоциированные с РЖ (35 из области ВР и 29 из области НР; см. рис. 1, Б и рис. 2, Б) [7-9].

Рисунок 1. MLST-анализ 64 штаммов cagA+ vacA s1m1 Helicobacter pylori из Колумбии. а - филогенетическое древо, построенное методом присоединения соседа; ветви представлены в масштабе, чтобы показать эволюционное расстояние. ° с зелеными линиями - изоляты из области низкого риска развития рака желудка; ∙ с синими линиями - изоляты из области высокого риска развития рака желудка. Скобки обозначают подразделение штаммов на 2 группы; б - распределение штаммов, происходящих из той или иной области риска, по филогенетическим группам, приведенным в а.
Рисунок 2. T-анализ 64 изолятов cagA+ vacA s1m1 Helicobacter pylori из областей НР и ВР в Колумбии и 380 референтных штаммов, ранее отнесенных к разным наследственным гаплогруппам [34]. а - филогенетическое древо, построенное методом присоединения соседа с использованием бутсрепинга 10 000 испытаний. Ветви представлены в масштабе, чтобы показать эволюционное расстояние. ° - изоляты из области НР; ∙ - изоляты из области ВР. Цвет ветвей соответствует подразделению штаммов на различные анцестральные гаплогруппы [34]; б - распределение штаммов, происходящих из той или иной области риска, по филогенетическим группам, приведенным на рис. 2а.
Поэтому мы сконцентрировали внимание на этих 64 штаммах cagA+vacA s1m1. Анализировали филогенетические взаимосвязи между 64 конкатенированными наборами последовательностей генов «домашнего хозяйства» (рис. 1, А). Мы идентифицировали 2 отличающиеся группы штаммов. Все 20 штаммов 1-й группы происходили из области НР, а во 2-й все изоляты (35 из 35) были получены из области ВР. Остальные 9 изолятов были из области НР (р<0,0001 для сегрегации групп; см. рис. 1, Б).

Все штаммы H. pylori из области высокого риска имеют европейское филогеографическое происхождение.

Затем мы предприняли второй MLST-анализ, сопоставляя последовательности 64 колумбийских штаммов и 380 референтных штаммов, которые были предварительно классифицированы на анцестральные (предковые) гаплогруппы [34]. Как следует из филогенетического древа, построенного методом присоединения соседа (рис. 2, а), штаммы H. pylori, идентифицированные в Колумбии, относятся исключительно к hpEurope или к hpAfrica1 и ни один к hpЕAsia (hspAmerind или hspEAsia). Следует отметить, что 35 (100%) из 35 изолятов, полученных из области ВР, относятся к hpEurope. Только 10 (34,5%) из 29 штаммов из области НР относятся к hpEurope, а остальные 19 - к hpAfrica1 (3 hspSAfrica и 16 hspWAfrica). Таким образом, все колумбийские штаммы, относящиеся к hpAfrica1, были получены из области НР. Классификация изолятов в базе данных MLST полностью соответствовала их географическому происхождению в пределах Колумбии (p<0,0001; см. рис. 2, Б). Следует отметить также, что сегрегация колумбийских штаммов в контексте референтных штаммов отражала ситуацию, когда анализировались только колумбийские штаммы, поскольку 19 (95%) из 20 штаммов 1-й группы (см. рис. 1) были отнесены к hpAfrica1 (см. рис. 2) и 44 (100%) из 44 из 2-й группы (см. рис. 1) - к hpEurope (см. рис. 2).

Кроме того, мы провели MLST-анализ 17 остальных штаммов (не cаgA+ vacA s1m1) (дополнительная табл. S2). Все штаммы cаgA классифицировались как hpEurope. При включении в анализ дополнительных штаммов вместе с

64 штаммами cаgA+ и vacA s1m1 было установлено, что все они (n=41; 100%), выделенные в области ВР, принадлежат к hpEurope, а большинство (56%) штаммов из области НР - к hpAfrica1. Таким образом, классификация всех штаммов вместе взятых в рамках MLST выявляет значительное различие между изолятами из областей ВР и НР (р<0,0001).

Штаммы H. pylori европейского филогеографического происхождения ассоциируются с более выраженными гистологическими изменениями.

Мы оценивали прогрессирование заболевания у пациентов, от которых были получены штаммы для культивирования, характеризуя биоптаты желудка с помощью апробированной системы. Эта система основана на модифицированных сиднейской и падуанской классификациях и позволяет оценивать тип и степень гистологических изменений [25-27]. Гистологические изменения анализировали с помощью линейной многофакторной модели. У пациентов из области ВР имелись более выраженные изменения (в среднем 3,9 при 95% ДИ от 3,6 до 4,2) чем у жителей области НР (в среднем 3,2 при 95% ДИ от 2,9 до 3,6) (рис. 3, А).

Рисунок 3. Гистопатологический анализ биоптатов, взятых у инфицированных колумбийскими штаммами Helicobacterpylori пациентов. Гистологическая оценка по 6-балльной шкале (как описано в разделе «Методы»; каждый значок соответствует баллу для конкретного пациента). а - гистопатологические оценки по областям риска; б - оценки, сгруппированные по филогенетическим категориям штаммов. Горизонтальные линии соответствуют средним значениям; значения р получены посредством анализа с использованием линейной многофакторной модели.
Анализ полученных оценок на основании MLST-классификации штаммов H. pylori (рис. 3, б) позволил выявить еще более значительное различие между степенью прогрессирования предраковых гистологических изменений у пациентов, от которых получены изоляты hpEurope (в среднем 3,9 при 95% ДИ от 3,6 до 4,2) и hpAfrica1 (в среднем 2,9 при 95% ДИ от 2,5 до 3,3; р=0,001). Поскольку в европейскую группу входили изоляты как из области ВР (горной), так и из области НР (прибрежной), полученные результаты позволяют ставить вопрос об относительной важности филогенетических характеристик по сравнению с географическим распространением как предикторов клинического исхода инфекции H. pylori. Поэтому мы сравнили 3 группы: hpEurope из области НР, hpAfrica1 из этой же области и hpEurope из области ВР (рис. 4, А).
Рисунок 4. Гистопатологический анализ биоптатов, взятых у инфицированных колумбийскими штаммами Helicobacter pylori пациентов. Гистологическая оценка по 6-балльной шкале (как описано в разделе «Методы»; каждый значок соответствует баллу для конкретного пациента). а - оценки, сгруппированные по филогенетическим категориям штаммов в пределах данной области риска. Горизонтальные линии соответствуют средним значениям; парное сравнение проводилось с использованием критерия Даннета и поправки Шидака; б - репрезентативные микрофотографии 8-OHdG-окрашивания ткани желудка: 1 - биоптат пациента из области НР, инфицированного штаммом hpAfrica1, с неатрофическим гастритом; 2 - биоптат пациента из области НР, инфицированного штаммом hpEurope, с КМ и неявными диспластическими изменениями; 3 - биоптат пациента из области ВР, инфицированного штаммом hpEurope, с КМ. Ув. 200.
В области НР у лиц, инфицированных штаммами hpAfrica1, гистологические изменения были менее выраженные (в среднем 2,9 при 95% ДИ от 2,5 до 3,3), чем у инфицированных штаммами hpEurope (в среднем 3,9; 95% ДИ от 3,3 до 4,4; р=0,032; рис. 4, Б). Гистопатологические изменения были одинаковыми (см. рис. 4, А) у носителей штаммов hpEurope из областей с низким риском развития рака желудка (в среднем 3,7 при 95% ДИ от 3,4 до 4,1) и областей с высоким риском развития рака желудка (в среднем 3,9 при 95% ДИ от 3,3 до 4,4; см. рис. 4, Б).

Мы анализировали также биоптаты СО желудка, используя классификацию хронического гастрита OLGA-system [31] для оценки атрофии и КМ. Как и при анализе с помощью нашей системы гистопатологических оценок, у лиц из области с высоким риском развития рака желудка выявлена в среднем более высокая стадия по системе OLGA, чем у жителей области с низким риском развития рака желудка (см. рис. 1, Б), а у инфицированных штаммами hpEurope - более высокая, чем у инфицированных штаммами hpAfrica1 (см. рис. 1, Б). В пределах области с низким риском развития рака желудка у лиц, инфицированных штаммами hpEurope, имелась более высокая стадия, чем у инфицированных штаммами hpAfrica1, причем первая группа достоверно не отличалась по этому показателю от группы, инфицированной штаммами hpEurope в области с высоким риском развития рака желудка (см. рис. S1C).

Штаммы H. рylori европейского филогеографическго происхождения ассоциируются с более выраженными поражениями ДНК в эпителиальных клетках желудка

Установлено, что индукция повреждений ДНК является важным шагом в развитие канцерогенеза при инфекции H. pylori. Последняя ассоциируется с воспалением, приводящему к окислительному повреждению ДНК [10, 11] в дополнение к непосредственному оксидативному стрессу на эпителиальные клетки желудка самого микроорганизма [37]. В связи с этим мы оценивали поражение ДНК иммуногистохимическими методами, используя антитела к маркеру окислительного поражения ДНК 8OHdG с последующим подсчетом положительно окрашенных ядер в эпителиальных клетках. С помощью многофакторной линейной модели мы показали, что биоптаты, взятые у пациентов из области с высоким риском развития рака желудка, содержали больше 8OHdG-положительных клеток (в среднем 45,6% при 95% ДИ от 38,5 до 52,8%), чем у пациентов из области с низким развитием рака желудка (в среднем 31,2% при 95% ДИ от 23,5 до 38,4%; р=0,09;

рис. 5, а).

Рисунок 5. Определение окислительного повреждения ДНК в биоптатах желудка посредством подсчета числа 8-OHdG-положительных ядер в эпителиальных клетках (в процентах). а - уровни окрашивания 8-OHdG по областям риска; б - случаи, сгруппированные по филогенетическим категориям штаммов. Горизонтальные линии соответствуют средним значениям; статистическая обработка данных производилась, как для рис. 3.
Различие было еще больше при сравнении всех пациентов, инфицированных штаммами hpEurope (в среднем 46% при 95% ДИ от 40,1 до 51,9%), со всеми пациентами, инфицированными штаммами hpAfrica1 (в среднем 22,7% при 95% ДИ от 13,4 до 31,9%; рис. 5, б). У жителей области с низким развитием рака желудка, инфицированных штаммами hpAfrica1, количество 8OHdG-положительных клеток было меньше (в среднем 22,7% при 95% ДИ от 13,3 до 32,1%), чем у инфицированных штаммами hpEurope (в среднем 45,2% при 95% ДИ от 33 до 57,4%; р=0,007; рис. 6). В биоптатах, взятых у носителей штаммов hpEurope из области с высоким риском развития рака желудка, количество 8OHdG-положительных клеток было недостоверно больше (в среднем 46,2% при 95% ДИ от 39,5 до 53%), чем у носителей тех же штаммов из области с низким развитием рака желудка (в среднем 45,2% при 95% ДИ от 33 до 57,4%; см. рис. 6).
Рисунок 6. Определение окислительного повреждения ДНК в биоптатах желудка посредством подсчета числа 8-OHdG-положительных ядер в эпителиальных клетках. а - случаи, сгруппированные по филогенетическим категориям штаммов в пределах данной области риска. Горизонтальные линии соответствуют средним значениям; статистическая обработка данных производилась также, как для рис. 4; б - репрезентативные микрофотографии 8-OHdG-окрашивания желудочной ткани: 1 - биоптат пациента из области низкого риска, инфицированного штаммом hpAfrica1; 2 - биоптат пациента из области низкого риска, инфицированного штаммом hpEurope, с КМ и неявными диспластическими изменениями; 3 - биоптат пациента из области высокого риска, инфицированного штаммом hpEurope. Ядра с повреждениями ДНК окрашены

Обсуждение

То, что все обследованные жители высокогорных районов Анд в Колумбии были инфицированы штаммами hpEurope, а жители тихоокеанского побережья являлись носителями штаммов H. pylori как европейского, так и африканского происхождения (с преобладанием последних), позволяет предполагать, что метисы из горной области ВР утратили анцестральные (предковые) американо-индейские штаммы, тогда как мулаты, населяющие прибрежную область НР [18, 20, 21], остаются носителями штаммов H. pylori, унаследованных от своих африканских предков, которые были завезены в Новый Свет во времена работорговли. Предполагается, что американские индейцы были исходно инфицированы штаммами hspAmerind, относящимися к группе hpEAsia [34], тогда как метисы из горных районов Анд инфицированы (по данным нашего исследования) исключительно штаммами hpEurope. Это предполагает более выраженную конкурентоспособность последних по сравнению с местными штаммами hspAmerind. В исследовании, включавшем 22 метисов из Колумбии и Венесуэлы, были выявлены носители только hpEurope и hpAfrica1 [38], однако авторы не оценивали взаимосвязь между классификацией штаммов в MLST и показателями риска возникновения рака. По мнению ряда исследователей, люди могут быть инфицированы

H. pylori более одного штамма [39, 40]. Однако проведенное нами тестирование генетической изменчивости бактерий с использованием ПЦР и праймеров повторяющихся энтеробактериальных межгенных консенсусных последовательностей показало, что во всех случаях произвольно выбранных для анализа (n=28) колонии, выделенные из антрального отдела и тела желудка каждого пациента, имели одинаковые профили (фингерпринты) ДНК. Более того, во всех 12 случаях, включенных в дальнейшее исследование, 4 колонии (2 из антрального отдела и 2 из тела желудка) оказались идентичными.

Мы показали, что (как и следовало ожидать) частота гистологических поражений и повреждений ДНК у жителей горной области с высоким риском развития рака желудка была выше, чем среди населения прибрежной области с низким развитием рака желудка. Представленные в настоящем сообщении данные позволяют объяснять это различие филогеографическим происхождением штаммов, инфицирующих указанных лиц. Исходя из этой концепции мы изучили поведение 10 штаммов из обеих областей риска при их совместном культивировании с эпителиальными клетками желудка и выявили значительное увеличение окислительного повреждения ДНК (измерявшегося методом проточной цитометрии с использованием 8-оксогуанозина [37]) в присутствии штаммов из горной области по сравнению со штаммами из прибрежной области. Сходным образом была продемонстрирована повышенная частота повреждения ДНК в клетках, инфицированных штаммами hpEurope, по сравнению с инфицированными штаммами hpAfrica1 (данные не приводятся). Эти наблюдения подтверждают нашу гипотезу, согласно которой штаммы H. pylori из двух областей с разным риском возникновения РЖ существенно различаются по патогенности вследствие их разного филогеографического происхождения.

Полученные нами результаты противоречат ранее принятому мнению, согласно которому различия в частоте развития РЖ в отдельных регионах Латинской Америки обусловлены не только этническими различиями, но также условиями проживания и характером питания населения: высокогорье и обогащенный крахмалом рацион в областях с высоким риском развития рака желудка, в отличие от равнинной местности и преобладанием морепродуктов в областях с низким риском развития рака желудка [18]. Недавно мы показали, что в настоящее время население этих двух регионов существенно не различается по характеру домашнего хозяйства, плотности, потреблению витаминных добавок и поваренной соли, а также привычке к курению [20]. Следовательно, эти показатели не могли повлиять на результаты обсуждаемого исследования. Кроме того, в ходе анализа курения [20] мы не выявили различий по характеру гистопатологических изменений и окрашиванию 8OHdG у курящих и некурящих пациентов. Мы показали, что в прибрежной области (с низким развитием рака желудка), где население инфицировано штаммами либо hpEurope, либо hpAfrica1, дивергенция генетических свойств H. pylori, находящая отражение в их филогеографическом происхождении, служит чрезвычайно важным фактором, которым объясняется разный характер наблюдаемых предраковых гистологических изменений и окислительного повреждения ДНК. Жители области с низким развитием рака желудка сходны в этнографическом отношении, но при инфицировании штаммами hpEurope их ткани желудка характеризуются значительно большей частотой атрофии, КМ и дисплазии, чем при инфицировании hpAfrica1, что подчеркивает большое значение филогеографического происхождения штаммов. Генетические особенности хозяина также могут играть важную роль. В связи с этим мы планируем изучить в будущих исследованиях митохондриальную ДНК колумбийцев, проживающих в областях высокого и НР развития РЖ.

Имеются сообщения о тесной связи между распространенностью генотипов cag PAI и vacA s1m1 и повышенной вероятностью возникновения РЖ среди населения Латинской Америки [41]. Это подтверждается и полученными нами данными, согласно которым у лиц, инфицированных штаммом cagA– (см. рис. 1, б и рис. 2, б), имеются лишь незначительные гистопатологические изменения при неатрофическом гастрите (данные не приводятся). Следует отметить, что все штаммы cagA–, выделенные в настоящем исследовании, относятся к hpEurope (см. рис. 2, Б). При сравнении гистологических данных мы уделяли основное внимание лицам, инфицированным штаммами cagA+vacA s1m1, поскольку включение в анализ также штаммов cagA– привело бы к искажению конечных результатов. Важно, что все носители штаммов cagA+ и vacA s1m1 значительно различались по степени прогрессирования гистологических признаков заболевания и повреждения эпителиальной ДНК, которая коррелировала с типом штаммов H. pylori по классификации MLST. Это подтверждает, что и другие характеристики штаммов (помимо принадлежности к cagA или vacA) тесно связаны с риском заболевания. Полученные нами данные о филогенетических особенностях штаммов H. pylori открывают новые возможности для стратификации рисков и создают основу для поиска специфических генетических особенностей, которыми отличают штаммы H. pylori европейского и африканского происхождения, с целью более глубокого понимания механизмов канцерогенеза желудка. Мы рассчитываем, что технологии следующего поколения для секвенирования полного генома H. pylori будут способствовать идентификации детерминант риска развитии рака в будущих исследованиях.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail