Микроокружение опухоли, или опухолевая строма, играет критическую роль в регулировании опухолевых клеток. Оно участвует в онкогенезе путем индукции эпителиально-мезенхимального перехода опухолевых клеток [1]. Опухолево-стромальное соотношение (tumor-stromal ratio) — прогностический критерий, подразделяющий все опухоли на stroma-low и stroma-high в зависимости от площади стромы в опухоли, посчитанной на окрашенных гематоксилином препаратах [2]. При колоректальном раке, а также при других солидных эпителиальных опухолях с высоким содержанием стромы отмечается плохой прогноз [3—5]. В дополнение к площади стромы важную роль в поведении карциномы может играть состав стромы. Несколько транскриптомных и иммуногистохимических исследований показали, что десмопластическая строма связана с плохим исходом у пациентов и может предсказать ответ на терапию [6, 7]. Десмопластическая реакция состоит в основном из активированных фибробластов, также называемых опухолеассоциированными фибробластами (cancer-associated fibroblasts, CAF). CAFs представляют собой гетерогенную клеточную популяцию с точки зрения происхождения и биологической функции и происходят в основном из мезенхимальных клеток, которые являются резидентными или рекрутируются опухолью [8]. Они расположены близко к эпителиальным клеткам и другим компонентам стромы, таким как иммунные клетки, кровеносные сосуды и компоненты внеклеточного матрикса. Фибробласт — это общий термин, который включает резидентные покоящиеся фибробласты, CAFs, миофибробласты и перициты. Идентификация и номенклатура фибробластов, присутствующих в опухоли, остаются сложными из-за отсутствия специфических маркеров для известных и все еще неопределенных подтипов.
Цель работы — оценка коэкспрессии потенциальных маркеров CAF и их тропности к сосудам и опухолевым почкованиям. Маркерами CAF считаются белок активации фибробластов (FAP), рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFRβ), подопланин (POD) [9]. Все обозначенные маркеры не являются специфичными для CAF. Так, FAP также экспрессируется воспалительными клетками, PDGFRβ определяются на перицитах [10, 11], POD — в лимфатических сосудах. Для выявления сосудов использовался CD31 (и POD), а для оценки опухолевых почкований — Pancytokeratin (PCK) (табл. 1).
Таблица 1. Локализация используемых маркеров
Маркер | Экспрессия маркера | Субпопуляция |
CD31 | Кровеносные сосуды | Эндотелиальные клетки |
POD | Лимфатические сосуды, опухолевая строма | CAF, эндотелиальные клетки лимфатических сосудов |
PDGFRβ | Кровеносные сосуды, опухолевая строма | CAF, перициты, миофибробласты |
FAP | Опухолевая строма | CAF |
Материал и методы
В исследование включено 10 аденокарцином lowgrade толстой кишки от 10 пациентов с I—III стадией заболевания, не получавших неоадъювантную терапию. Средний возраст пациентов составил 70,8 года. В полуавтоматическом режиме с использованием автостейнера Autostainer 480S («Thermo Scientific», Англия) проводилось мультиплексное окрашивание с помощью набора для семицветного ручного иммуногистохимического окрашивания OPAL 7-COLOR MANUAL IHC KIT («Akoya Biosciences», США) с пятью антителами (табл. 2).
Таблица 2. Характеристики используемых антител
Антитело | Цвет | Клон | Производитель | Разведение | Время инкубации, мин | Тип антитела (Ms/Rb) | Флуорохром |
FAP | | SP325 | «Abcam» | 1:75 | 20 | Rb | Opal 520 |
PDGFRβ | | Y92 | «Abcam» | 1:500 | 20 | Rb | Opal 540 |
CD31 | | JC70A | «Dako» | RTU | 30 | Mo | Opal 650 |
POD | | EPR22182 | «Abcam» | 1:4000 | 20 | Rb | Opal 570 |
PCK | | AE1/AE3 | «Dako» | RTU | 30 | Mo | Opal 620 |
Протокол окрашивания:
1) депарафинизация и регидратация;
2) демаскировка антигенов в AR9 Buffer («Akoya Biosciences», США) (20 мин);
3) пероксидазный блок («Leica Biosystems»);
4) отмывка в стандартном растворе PBS (5 мин);
5) нанесение и инкубация первого первичного антитела (см. табл. 2);
6) две отмывки в PBS (по 5 мин);
7) нанесение и инкубация вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Opal Polymer HRP Ms + Rb, входит в комплект);
8) две отмывки в PBS (по 5 мин);
9) нанесение и инкубация соответствующего флуорохрома Opal (10 мин);
10) две отмывки в PBS (по 5 мин);
11) повторная демаскировка (20 мин);
12) повторение этапов 4—11 (4 раза для окрашивания пятью антителами; после третьей демаскировки сменили AR9 Buffer на новый).
...
44) нанесение и инкубация DAPI;
45) нанесение спирта на стекло, высушивание;
46) заключение в среду.
Для определения последовательности нанесения антител перед мультиплексным окрашиванием проводилось моноокрашивание каждым антителом с последующей пятикратной демаскировкой и нагревом до 98,5 °C в AR9 Buffer и оценкой сохранности реакции после каждого кипячения. Адекватной последовательностью стало окрашивание в следующем порядке:
FAP→PDGFRβ→CD31→POD→PCK.
Парафиновые блоки отбирали таким образом, чтобы в срез попали все зоны опухоли: обращенная в просвет (апикальная), инвазивная и центральная. В каждом случае осуществляли оценку при увеличении объектива в 20 раз. В работу включали по 3 поля зрения в каждой зоне с обязательной фиксацией в качестве зоны интереса инвазивного края реакции стромы вокруг опухолевых почкований (при наличии), которые хорошо идентифицировались благодаря реакции с PCK. Общий массив анализируемых данных составил 93 зоны, которые оценивали сначала в совокупности, а затем по отдельности: апикальная/центральная/инвазивная.
Система для мультиплексной визуализации Mantra 2 Quantitative Pathology Imaging System предназначена для детекции флуорохромов с близкими спектрами возбуждения/излучения за счет флюоресцентных фильтров и монохромной высокочувствительной ПЗС-камеры с настраиваемым спектральным фильтром на жидких кристаллах. Прибор позволяет визуализировать до 9 флуорохромов без перекрытий спектров и автоматически удалять сигнал автофлюоресценции с образца, а также проводить съемку отдельных областей интереса при увеличении в 4, 10, 20 и 40 раз. С помощью программного обеспечения Inform («Akoya») произведены анализ результатов окрашивания и оценка действия между клетками непосредственно на препарате ткани:
— автоматическая сегментация изображения по типу ткани;
— автоматический подсчет клеток;
— автоматическое фенотипирование иммунных, опухолевых и других типов клеток по совокупности коэкспрессируемых маркеров;
— просмотр результатов флюоресцентного окрашивания в виде гистологических препаратов в светлом поле;
— статистический анализ расположения клеток относительно друг друга и их распределения относительно ткани опухоли.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы PASW Statistics 22. Для множественных сравнений количественных данных в несвязанных выборках применяли непараметрический критерий Краскела—Уоллиса. Для множественных сравнений качественных данных использовали критерий χ2.
Для сравнения количественных данных в двух связанных совокупностях применяли непараметрический критерий Уилкоксона. Для графического представления данных использовали диаграммы-боксплоты с обозначенными на них медианой, 25-м и 75-м процентилями и полуторным межквартильным размахом, а также «выбросами», выходящими за пределы полуторного (°) и тройного (*) межквартильных размахов, и диаграммы среднего значения с обозначенным на них двойным стандартным отклонением.
Результаты и обсуждение
После машинного обучения программа идентифицировала области микропрепаратов, размеченные как «опухоль» и «строма», производился автоматический подсчет площади (в % к площади поля зрения) каждой зоны, а также площади метки исследуемых маркеров в этой зоне.
Для точности определения стромально-опухолевого соотношения в качестве финальной цифры площади стромы (в %) было взято среднее значение по трем полям зрения в каждой зоне. Полученные данные представлены в табл. 3. Ввиду малой выборки корреляционный анализ провести не удалось, но визуально видно, что в случаях с низким стромально-опухолевым соотношением (по инвазивному краю, учитывая пороговое значение 50%, согласно [2]) метастазы в лимфатических узлах отсутствуют. Также видна гетерогенность в стромально-опухолевом соотношении в различных зонах с преимущественным увеличением в инвазивном крае (см. табл. 3).
Таблица 3. Стромально-опухолевое соотношение в выборке
Случай | Средняя площадь стромы в зоне (% к площади поля зрения) | Стромально- опухолевое соотношение* | Наличие опухолевых почкований | Число лимфатических узлов с метастазами | ||
апикальной | центральной | инвазивной | ||||
1 | 44,63 | 30,36 | 48,51 | Низкое | Нет | 0 |
2 | 54,20 | 84,13 | 54,02 | Высокое | Есть | 3 |
3 | 44,80 | 55,96 | 22,57 | Низкое | Нет | 0 |
4 | 59,38 | 64,43 | 57,83 | Высокое | » | 4 |
5 | 35,56 | 37,06 | 51,57 | » | Есть | 8 |
6 | 39,76 | 27,05 | 62,10 | » | » | 0 |
7 | 51,28 | 34,30 | 75,26 | » | » | 3 |
8 | 54,41 | 54,97 | 62,09 | » | » | 5 |
9 | 65,59 | 74,32 | 66,50 | » | Нет | 7 |
10 | 57,50 | 47,14 | 46,00 | Низкое | Есть | 1 |
Примечание. * — значение <50% средней площади стромы в инвазивной зоне трактовалось как низкое, >50% — как высокое.
Статистически значимой разницы по уровню каждого из маркеров (PDGFRβ, POD, FAP, CD31) в трех зонах не выявлено (рис. 1). По графикам видно, что средние значения маркеров CAF схожи (среднее значение POD — 38,65%, FAP — 41,64%, PDGFRβ — 33,36%), а среднее значение маркера кровеносных сосудов CD31 — 5,68%.
Рис. 1. Средние (скорректированные на площадь) значения маркеров в различных зонах опухоли.
Одна из основных задач — оценка колокализации маркеров CAF. Для этого попарно сравнивали маркеры и подсчитывали следующие показатели:
1) площадь, отрицательную на оба маркера (Sотр);
2) площадь, положительную на оба маркера (SA+B);
3) площадь реакции каждого маркера в паре (SA; SB).
Всего было исследовано 6 пар маркеров, экспрессируемых в строме: CD31+FAP, CD31+PDGFRβ, CD31+POD, FAP+PDGFRβ, FAP+POD, PDGFRβ+POD.
Маркер CD31 был использован для детекции сосудов и оценки реакции вокруг них, а не с целью поиска потенциальной колокализации. Остальные маркеры (FAP, PDGFRβ, POD), предположительно являющиеся маркерами CAF, оценивали вместе для выявления их совместного окрашивания. Площадь (S) совместного окрашивания определяли только в окрашенной части и расценивали по формуле:
.
Данное допущение стало возможно благодаря тому, что программное средство Inform обладает высокой чувствительностью и способно в качестве зоны интереса выделять и анализировать одну клетку.
Площадь (S) различного окрашивания вычисляли по формуле:
.
Данные с площадями совместного и различного окрашивания, позволяющие судить о колокализации маркеров, представлены в виде boxplot на рис. 2.
Рис. 2. Колокализация маркеров.
Полученные данные свидетельствуют, что маркеры CD31 и CAF экспрессируются принципиально в разных локализациях (p<0,0001) для всех пар (CD31+FAP, CD31+PDGFRβ, CD31+POD). На графиках (см. рис. 2) видно, что средние значения и медиана совместного окрашивания CD31 и маркеров CAF значимо меньше, чем эти же показатели при их различном окрашивании. Дополнительно колокализация была оценена в различных зонах в отдельности (апикальная, центральная, инвазивная). Разнонаправленное действие CD31 и маркеров CAF подтвердилось в каждой зоне в отдельности (p<0,001), что согласуется с данными T. Sandberg и соавт. [12].
Противоположные данные получены по парам FAP+PDGFRβ и FAP+POD (p<0,0001), где значимо выше оказалась площадь их совместного окрашивания (см. рис. 2). Это говорит о том, что данные маркеры обнаруживаются на одних и тех же стромальных клетках (предположительно CAF), а учитывая гетерогенность CAF, эти маркеры выявляют одни и те же популяции.
В паре FAP+PDGFRβ в различных зонах была выявлена различная значимая статистическая взаимосвязь по колокализации маркеров: в апикальной зоне опухоли менее значимая (p=0,031), а центральной и инвазивной — более значимая (p=0,008 и p=0,001) (рис. 3).
Рис. 3. Реакция исследуемых маркеров в различных зонах опухоли.
Зоны опухоли: а, б — апикальная; в, г — центральная; д, е — инвазивная. Мультиплексное флюоресцентное окрашивание OPAL 7-COLOR MANUAL IHC KIT («Akoya Biosciences», США) с пятью антителами, об. ×20.
В паре FAP+POD не во всех зонах в отдельности удалось выявить статистически значимую взаимосвязь по колокализации маркеров: в апикальной зоне опухоли значимую (p=0,011), а центральной и инвазивной — незначимую (p=0,072 и p=0,067). Эти данные свидетельствуют, что маркеры FAP и POD окрашивают одни и те же элементы лишь в апикальной зоне, что, скорее всего, связано с популяцией молодых фибробластов, активно пролиферирующих в зоне изъязвления и грануляций, но не с популяцией CAF.
В паре POD и PDGFRβ различия оказались статистически незначимы ни по совокупности всех зон, ни по каждой зоне в отдельности, в связи с чем по имеющейся выборке не удалось установить характер распределения и взаимодействие этих маркеров.
Вручную 3 патологоанатомами оценивалось распределение маркеров CAF (FAP, PDGFRβ, POD) вокруг опухолевых почкований (в 6 из 10 случаев, где они имелись) и вблизи окрашенных CD31 сосудов (рис. 4).
Рис. 4. Реакция исследуемых маркеров вокруг опухолевых почкований в инвазивном крае.
Мультиплексное флюоресцентное окрашивание OPAL 7-COLOR MANUAL IHC KIT с пятью антителами, об. ×20.
Во всех 6 случаях с опухолевыми почкованиями наблюдается выраженная видимая реакция FAP вблизи них (см. рис. 4). Также складывается впечатление, что в случаях, где есть опухолевые почкования, наблюдается более высокий уровень POD в инвазивном крае (среднее значение в случаях без почкований — 40,3%; в случаях с почкованиями — 78,2%; табл. 4). Ранее с помощью дуплексной иммуногистохимической метки было показано отсутствие необходимости оценивать POD непосредственно вокруг опухолевых почкований, поскольку реакция вокруг них соответствовала уровню реакции POD в инвазивном крае [13]. Эти данные отличаются от мировых: авторы отмечают корреляцию между снижением безрецидивной выживаемости и отсутствем экспрессии POD в CAF центральной зоны [14] и не выявили корреляцию между выживаемостью и уровнем POD в инвазивном крае.
Таблица 4. Средние уровни маркеров в инвазивном крае и наличие опухолевых почек
Случай | Наличие опухолевых почкований | Средняя площадь реакции (% к площади поля зрения) | |||||
POD в инвазивном крае | FAP в инвазивном крае | PDGFRβ в инвазивном крае | |||||
1 | Нет | 65,7 | 36,61 | 30,97 | |||
3 | » | 62,66 | 95,44 | 67,53 | |||
4 | » | 5,93 | 92,96 | 85,8 | |||
9 | » | 27,04 | 98,79 | 37,3 | |||
2 | Есть | 70,21 | 86,34 | 87,3 | |||
5 | » | 92,86 | 94,65 | 64,89 | |||
6 | » | 91,91 | 99,79 | 75,89 | |||
7 | » | 86,07 | 99,4 | 89,22 | |||
8 | » | 79,53 | 57,21 | 18,26 | |||
10 | » | 48,65 | 85,64 | 59,89 | |||
Среднее значение | 40,3 | 78,2 | 80,9 | 87,17 | 55,4 | 65,9 |
В случаях с опухолевыми почкованиями и без них средний уровень FAP не отличался (80,9 и 87,17%), однако при наличии опухолевых почкований менялось их распределение в препарате, в таких случаях большая часть FAP- положительных клеток концентрировалась вокруг опухолевых почкований. Средняя площадь PDGFRβ была сопоставима (см. табл. 4).
Вокруг сосудов, окрашенных CD31, чаще всего обнаруживалась реакция POD (см. рис. 3, а, б) и FAP (см. рис. 3, а), однако из-за гетерогенности распределения маркеров и малой выборки статистически значимых выводов получить не удалось.
Заключение
При оценке колокализации маркеров CAF (FAP, PDGFRβ, POD) между собой и с маркером сосудов CD31 в различных зонах колоректальных карцином выявлена статистически значимая колокализация в паре FAP+PDGFRβ, свидетельствующая об экспрессии этих маркеров в одних и тех же стромальных клетках, предположительно CAF. Установлена статистически значимая колокализация в паре FAP+POD в апикальной зоне опухоли, свидетельствующая об экспрессии этих маркеров в одних и тех же стромальных клетках, предположительно незрелых фибробластах грануляционной ткани. Показано полное отсутствие колокализации между CD31 и маркерами CAF. Показана высокая экспрессия FAP в инвазивном крае опухоли непосредственно вблизи опухолевых почкований, что может иметь дополнительное клиническое значение.
Технология мультиплексной флюоресцентной ИГХ может представлять интерес не только для исследовательских проектов. Представляется перспективной разработка многокомпонентных диагностических наборов, например для диагностики рака предстательной железы (AMACR+CK-H+p63), рака молочной железы (HER2+ER+PR+Ki-67) и других стандартных диагностических панелей.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Н.А. Олейникова
Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова, П.Г. Мальков, О.А. Харлова
Статистическая обработка данных — О.А. Харлова
Написание текста — Н.А. Олейникова
Редактирование — П.Г. Мальков, Н.В. Данилова
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ, грант «Перспектива» №19-315-60006).
Коллектив авторов выражает признательность ООО «БиоЛайн» (Санкт-Петербург, Россия) за содействие в материально-техническом обеспечении и Д.В. Дьяковой (ООО «БиоЛайн») за консультативную и методическую помощь.