Мухамадияров Р.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Россия

Рутковская Н.В.

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово

Мильто И.В.

ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск, Россия; ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский политехнический университет», Томск, Россия

Сидорова О.Д.

ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, Кемерово, Россия

Барбараш Л.С.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Россия

Клеточный состав эксплантированных биопротезов клапанов сердца при инфекционном эндокардите

Журнал: Архив патологии. 2019;81(6): 16-23

Просмотров : 73

Загрузок : 6

Как цитировать

Мухамадияров Р. А., Рутковская Н. В., Мильто И. В., Сидорова О. Д., Барбараш Л. С. Клеточный состав эксплантированных биопротезов клапанов сердца при инфекционном эндокардите. Архив патологии. 2019;81(6):16-23. https://doi.org/10.17116/patol20198106116

Авторы:

Мухамадияров Р.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Россия

Все авторы (5)

Введение

Современные общемировые тенденции свидетельствуют о неуклонном росте применения биопротезов (БП) для коррекции приобретенных поражений клапанного аппарата сердца [1]. За рубежом данный факт является следствием увеличения среднего возраста оперируемых пациентов и преобладания в структуре пороков дегенеративных поражений нативных клапанов, тогда как в российских клиниках предпочтение ксеногенных БП зачастую возникает при невозможности достижения безопасного уровня медикаментозной гипокоагуляции и осуществления адекватного контроля основных показателей гемостаза [2, 3]. Таким образом, в нашей стране реципиентами БП достаточно часто становятся лица молодого и среднего возраста, ожидаемая продолжительность жизни которых предполагает выполнение повторных хирургических вмешательств по поводу развития дисфункции ксеноклапанов. Еще одним фактором, оказывающим влияние на возраст оперируемых больных в России, является высокий процент поражений инфекционного и ревматического характера. Настоящая тенденция отчасти связана с неудовлетворительным качеством оказания медицинской помощи пациентам и с бесконтрольным использованием антибиотиков на амбулаторном этапе [2].

Приведенные выше обстоятельства, с одной стороны, обусловливают большое число реимплантаций искусственных клапанов сердца, а с другой — увеличение числа дисфункций ксеногенных имплантируемых устройств, связанных с развитием позднего протезного эндокардита (ПЭ). Согласно данным клиники НИИ КПССЗ, инфицирование БП явилось показанием к выполнению повторных хирургических вмешательств в 26% случаев [4]. Таким образом, весьма актуальными остаются исследования процессов ремоделирования модифицированного внеклеточного матрикса при присоединении инфекционного поражения.

Ранее в серии наших работ продемонстрировано активное участие клеток реципиента в формировании деструктивных изменений БП, ассоциированных с их кальцификацией [5].

Цель настоящего исследования — изучение клеточного состава ксеноаортальных БП, удаленных при реоперациях в связи с развитием ПЭ.

Материал и методы

Исследованы 8 эпоксиобработанных ксеноаортальных свиных БП клапанов сердца моделей КемКор и ПериКор (ЗАО «НеоКор», Кемерово), извлеченных из митральной позиции при повторных хирургических вмешательствах в связи с развитием позднего ПЭ. В когорту реоперированных больных вошли 1 женщина и 7 мужчин. Средний возраст пациентов на момент выполнения повторных операций составил 55,5±6,2 года при средней продолжительности функционирования БП 7,8±2,3 года.

К критериям диагноза ПЭ отнесены клинические проявления инфекционно-токсического синдрома до проведения хирургических вмешательств, а также выявленные микробные вегетации при дооперационной эхокардиографии и последующем гистологическом исследовании эксплантированных клапанов, в то время как результаты гемокультур в большинстве случаев оставались отрицательными. Данное обстоятельство явилось следствием предшествующего использования антибактериальных препаратов широкого спектра действия.

Учитывая влияние гемодинамических нагрузок на структурную сохранность ксеногенных клапанов в организме реципиента, в исследование были включены лишь БП, удаленные из митральной позиции. Предварительно выполняли рутинную оценку всех эксплантированных устройств на содержание солей кальция. При обнаружении минеральных отложений в виде больших скоплений, вызывающих деструкцию соединительнотканных структур и значительно нарушающих послойное строение створок, образцы исключали из последующего анализа. Идентификация единичных мелкокристаллических включений не являлась препятствием к проведению дальнейших исследований.

Все удаленные клапаны подвергали стандартной гистологической оценке, кроме того, в 5 случаях выполняли иммуногистохимическое (ИГХ) типирование клеток в составе ксеногенного материала и морфологические исследования с использованием оригинальной методики, состоящей в изготовлении шлифов БП [6].

Для гистологического и ИГХ-исследования эксплантированные протезы целиком помещали в 4% водный раствор параформальдегида (48 ч, 4 °С). После фиксации из створок вырезали фрагменты для последующей гистологической проводки и заливки в парафиновую смесь Histomix («БиоВитрум», Россия). Из парафиновых блоков на полуавтоматическом микротоме (МЗП 01-Техном, Россия) готовили срезы (толщина 5 мкм), которые монтировали на предметные стекла с полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, США). Срезы Б.П. окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и по Граму—Вейгерту, а также проводили ИГХ-исследование.

ИГХ-типирование клеток выполняли с использованием следующих маркеров: СD3 (Т-лимфоциты), СD20 (В-лимфоциты), СD34 и VEGFR2 (эндотелиоциты), СD68 (моноциты/макрофаги), виментин (фибробласты), α-гладкомышечный актин (гладкие миоциты). В работе применяли моноклональные мышиные (СD3, СD20, СD34, СD68, виментин) и кроличьи (СD1, α-гладкомышечный актин), а также поликлональные кроличьи (VEGFR2) антитела (Novocastra Laboratories, Thermo Scientific и Spring Bioscience), реагирующие с антигенами человека.

Для выявления описанных выше маркеров проводили высокотемпературную демаскировку антигенов в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) — α-гладкомышечный актин, CD68, СD34, VEGFR2, СD3; в трис-ЭДТА-буфере (рН 9,0) — виментин; без демаскировки — СD20. Блокирование эндогенной пероксидазы, разведение первичных антител и время их экспозиции определяли согласно протоколам производителей первичных антител. Для обнаружения результатов ИГХ-реакции использовали полимерную визуализирующую систему Novolink (Polymer detection system) («Novocastra», Англия). Иммуноферментную реакцию останавливали, промывали срезы в фосфатном буфере (рН 7,4), после чего докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Параллельно с выявлением антигенов при каждом окрашивании проводили постановку положительного и отрицательного контролей.

Шлифы, полученные в результате заключения фрагментов клапанов в эпоксидную смолу, исследовали с применением световой микроскопии [6]. Створки Б.П. фиксировали в двух сменах 4% раствора параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (12 ч в каждом). Дегидратированные образцы заключали в аралдит (Sigma-Aldrich, США). Полученные блоки шлифовали до необходимой глубины и полировали поверхность с использованием прибора TegraPol-11 («Struers», Дания). Далее проводили полихромное окрашивание поверхности срезов по методу S. Aparicio и Р. Marsden [7], для этого использовали 1% раствор толуидинового синего на 1% растворе буры и 1% раствор основного фуксина. В результате этой процедуры ядра клеток окрашиваются в сине-фиолетовый, цитоплазма — в голубой, коллагеновые и эластические волокна — в ярко-красный и синий цвета соответственно.

Исследование препаратов и фотосъемку выполняли на микроскопе AXIO Imager A1 («Carl Zeiss», Германия) с помощью цифровой камеры Canon G5 («Canon», Япония).

Результаты

Скопления микроорганизмов, выявляемые при гистологическом исследовании эксплантированных БП, в большинстве случаев представляли собой очаги неправильной формы с нечеткими краями, сливающиеся между собой, интенсивно окрашенные в центре и менее интенсивно по периферии. Микробные колонии располагались либо на желудочковой и/или предсердной поверхности БП, либо локализовались в толще створок среди разрушенных соединительнотканных структур (рис. 1).

Рис. 1. Колонии микроорганизмов на поверхности (а) и в толще створок биопротеза (б). Окраска по Граму—Вейгерту, ×100.

В первом случае обнаруживали повреждение БП по типу полипозно-язвенного эндокардита. Вегетации, расположенные на поверхности БП, включали микроорганизмы, гнойные тельца, полинуклеарные лейкоциты и фибрин. При этом в участках их локализации выявляли некроз эндотелиальных клеток с нарушением конфлюентности покрова и деструкцию волокнистой основы БП с образованием язвенных дефектов. Кроме того, отмечали перифокальное разволокнение, разрыхление, фрагментацию и пикринофилию коллагеновых волокон, зачастую в сочетании с имбибицией соединительнотканных структур кровью.

Локализация бактерий в более глубоких слоях модифицированного внеклеточного матрикса БП в свою очередь сопровождалась выраженной деструкцией коллагеновых волокон в центральных участках исследуемых образцов (рис. 2, а).

Рис. 2. Поверхность створки биопротеза с деструкцией поверхности, разрушенными коллагеновыми волокнами, клеточной инфильтрацией (а) и сохраненным эндотелием и внеклеточным матриксом (б). Окраска толуидиновым синим и основным фуксином, ×400.

Следует отметить, что в некоторых образцах присутствие микроорганизмов в толще створок БП сочеталось со значительными дегенеративными изменениями поверхности эксплантированных клапанов (см. рис. 2, а), в то время как в отдельных случаях архитектоника внешних слоев внеклеточного матрикса в проекции колонизации и тканевой деструкции характеризовалась относительной сохранностью (см. рис. 2, а).

Данный факт позволяет предположить, что заселение исходно девитализированного материала БП микроорганизмами начинается в местах его непосредственного контакта с кровью реципиента с постепенным проникновением микроорганизмов в глубь створки БП.

Следует отметить, что после продолжительного периода функционирования створки эксплантированных БП обильно заселяются клетками. Наибольшая их плотность наблюдается в поверхностных слоях и участках разрушения коллагеновых волокон, локализованных в толще исследуемых образцов. Поверхности ксеноклапанов, свободные от отложений фибрина вне зон выраженной деструкции, как правило, покрыты монослоем клеток вытянутой формы с хорошо определяемой ядросодержащей зоной, ИГХ-идентифицируемых как CD34- и VEGFR2-позитивные, что указывало на их принадлежность к эндотелиоцитам (рис. 3, а).

Рис. 3. Створка биопротеза митрального клапана. Эндотелиоциты на поверхности (а) и в толще (б) створки Б.П. Гладкие миоциты (в) в поверхностном слое створок Б.П. Макрофаги (г) и фибробласты (д и е) в зоне деструкции коллагеновых волокон створки БП. Стрелки — капилляроподобные структуры с эритроцитами. а и б — ИГХ-реакция с антителами к CD34; б — ИГХ-реакция с антителами к гладкомышечному актину; д — ИГХ-реакция с антителами к CD68; д и е — ИГХ-реакция с антителами к виментину, ×200.

Кроме того, CD34- и VEGFR2-позитивные клетки также выявляли в толще створок БП, где они располагались изолированно или группами, выстилая щелевидные пространства и формируя капилляроподобные структуры (см. рис. 3).

Обращало на себя внимание присутствие в модифицированном биоматериале имплантированных БП веретеновидных клеток с ядрами палочковидной формы, характеризующихся ИГХ-реакцией на α-гладкомышечный актин (см. рис. 3, в). Причем если в поверхностных участках створок миоциты формировали широкий «пояс» компактно расположенных элементов, то плотность их распределения в глубоких слоях была значительно меньше.

В результате ИГХ-типирования также идентифицировали виментин-позитивные клетки, относящиеся к фибробластам реципиента. Они концентрировались преимущественно в зонах тканевой дезорганизации, располагаясь между разрыхленными коллагеновыми волокнами и в участках деструкции внеклеточного матрикса — в полостях, образующихся при разрушении волокнистой основы БП (см. рис. 3, д, е).

Наличие данных клеток может указывать на присоединение к дегенеративным процессам регенеративных, представляющих фибробластическую трансформацию. Подтверждением данного факта также явилось присутствие новообразованных коллагеновых волокон, которые отличались более рыхлым расположением и иными тинкториальными свойствами (рис. 4).

Рис. 4. Рыхлое расположение молодых коллагеновых волокон в створках биопротеза при инфекционном эндокардите. Наличие пикринофильного материала в толще створки БП. а — с предсердной поверхности створки; б — с желудочковой поверхности створки. Окраска по Ван-Гизону, ×200.

В ряде случаев процесс коллагенообразования затрагивал поверхностные участки створок, что, помимо изоляции очага инфекции в организме реципиента, позволяет предположить возможность дополнительной механической стабилизации структур имплантированного клапана.

В локусах фрагментации и лизиса коллагеновых волокон обнаружены единичные CD68-позитивные клетки, относящиеся к макрофагам (см. рис. 3, г).

Кроме того, как на поверхности, так и в глубоких слоях исследуемых образцов выявляли CD3- и CD20-позитивные клетки, присутствующие в небольшом количестве и идентифицируемые как Т- и В-лимфоциты соответственно. Малочисленность лимфоцитов в составе БП, на наш взгляд, является проявлением дисфункции иммунной системы — одного из звеньев патогенеза П.Э. Кроме того, можно предположить истощение продукции данных клеточных элементов и уменьшение их роли в элиминации возбудителя на поздних стадиях инфекционного поражения БП.

Отличительной особенностью участков, инфильтрированных сегментоядерными лейкоцитами, явилась прогрессирующая деструкция соединительнотканных структур, характеризующаяся выраженной дискомплексацией и деструкцией коллагеновых волокон с формированием полостей различных размеров.

Обсуждение

Технология изготовления БП клапанов сердца направлена на снижение иммуногенных свойств используемого ксеногенного материала за счет его девитализации. При этом сохранение целостности соединительнотканных элементов позволяет обеспечить необходимые механические характеристики имплантируемых конструкций [9]. Однако, как показывают результаты многочисленных исследований [4], в процессе функционирования в организме реципиента при постоянном контакте БП с кровью неизбежно возникают различные трансформации химически модифицированной ксеноткани, со временем приводящие к развитию несостоятельности искусственных клапанов. В серии наших предыдущих работ [5, 6, 9] представлено описание клеточного состава морфологически сохранных и кальцинированных БП, удаленных в результате реопераций или при аутопсии после продолжительного периода имплантации. Настоящее исследование в свою очередь посвящено изучению клеточных реакций и структурной модификации ксеноматериала в условиях инфицирования.

Результаты представленной работы демонстрируют, что развитию ПЭ в значительной степени способствует деструкция поверхности имплантированных клапанов, предшествующая заселению тканей БП клетками реципиента [9]. Среди клеточных элементов, идентифицированных в составе исследуемых образцов, отдельного внимания заслуживают эндотелиоциты, образующие в ряде наблюдений монослой на поверхности створок. В участках его разрушения происходит дезорганизация соединительнотканных структур, что облегчает фиксацию возбудителя к модифицированной ткани и потенцирует проникновение инфекционных агентов в глубь створки БП с дальнейшим распространением вдоль коллагеновых волокон. При этом появление аморфного слоя, отмечаемое на поверхности некоторых биологических клапанов, логично рассматривать в качестве защитной реакции организма реципиента, направленной на изоляцию очага инфекции.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов происходит разрушение коллагеновых волокон и привлечение в очаг деструкции циркулирующих в кровотоке иммунокомпетентных клеток реципиента [10, 11]. Подтверждением данной гипотезы являются наличие клеточных элементов преимущественно в поверхностных участках створок БП, их расположение вдоль соединительнотканных структур [5, 6], а также ассоциация между степенью дегенеративных изменений образцов створок с количеством и разнообразием идентифицируемых в их составе клеток.

Присутствие мононуклеарных фагоцитов подразумевает их активную роль в реализации защитной функции, направленной на элиминацию микроорганизмов. Вместе с тем вероятно участие данных клеток в процессах деструкции тканей БП с формированием полостей различных размеров и формы. Течение дегенеративных изменений в свою очередь сопровождается инициацией продукции экстрацеллюлярного матрикса фибробластами и гладкими миоцитами, формирующими на поверхности створок имплантированных клапанов плотную волокнистую соединительную ткань.

В большинстве исследуемых образцов наблюдали преимущественно поверхностную локализацию клеточных элементов. Исключение составили лишь гладкомышечные клетки (ГМК), которые в виде скоплений часто обнаруживают в толще створок Б.П. Большое количество гладких миоцитов, определяемое в инфицированном биоматериале, по всей видимости, является следствием трансформации циркулирующих в кровотоке полипотентных клеток-предшественниц [10]. Как известно, направление клеточной дифференцировки определяется влиянием различных экзо- и эндогенных стимулов, к числу которых, помимо химических факторов [11], могут быть отнесены механические деформации (растяжения и сжатия), возникающие в процессе функционирования БП [13]. Можно предположить, что ГМК, образующиеся в результате клеточной трансформации, в условиях инфекционного процесса в большей степени способны обеспечивать упругоэластические свойства ремоделированного ксеноматериала по сравнению с фиброцитами.

Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать возможность параллельного течения процессов деструкции внутреннего слоя створок БП и образования экстрацеллюлярного матрикса на их поверхностях, компенсирующего утрачиваемые механические характеристики ксеноткани и стабилизирующего подвижные структуры имплантированных клапанов.

Образование капилляров в модифицированном внеклеточном матриксе БП, вероятно, происходит в результате разрыхления ксеноматериала в процессе длительного функционирования. Можно предположить, что наблюдаемая в представленной работе эндотелизация поверхностей образующихся полостей является одним из начальных этапов ангиогенеза. В свою очередь присутствие в просвете новообразованных сосудов форменных элементов крови свидетельствует об их функциональной полноценности. Наличие зон неоваскуляризации способствует поддержанию репопуляции БП и обеспечивает нормальную жизнедеятельность клеток [12].

Таким образом, результаты выполненного исследования позволяют сделать заключение, что по аналогии с развитием кальцийассоциированных дисфункций ПЭ сопровождается заселением имплантированного ксеногенного материала клетками реципиента. Вероятно, модифицированный внеклеточный матрикс створок БП, подобно интактному, способен служить в качестве матрицы для клеточной колонизации, а использование в качестве консервирующего агента диглицидилового эфира этиленгликоля, обладающего минимальной цитотоксичностью, допускает реализацию данного процесса в условиях человеческого организма [14].

Итогом происходящего ремоделирования является как элиминация микроорганизмов, так и регенерация структурных повреждений. В него одновременно вовлечено несколько типов клеток, выполняющих свои функции в условиях инфекционного поражения структур Б.П. Макрофаги способствуют санации очагов инфицирования и деструкции ксеноткани; эндотелиоциты обеспечивают неоваскуляризацию и резистентность поверхности БП к микробной агрессии; фибробласты играют роль в новообразовании коллагена, а ГМК, вероятно, берут на себя функции формирования эластического каркаса створки и обеспечения механических свойств БП [15, 16].

Дальнейший сценарий развития патологического процесса может зависеть от агрессивности возбудителей ПЭ и состояния иммунологической реактивности организма реципиента, а также определяться системным и местным регулирующим влиянием, определяющим направление клеточной дифференцировки.

В целом доказательство колонизации эпоксиобработанных тканей клетками реципиента в процессе эксплуатации БП можно рассматривать в качестве иллюстрации пригодности используемого материала для разработки нового поколения клеточно-инженерных конструций с контролируемым заселением клетками реципиента. Например, предварительная изоляция поверхности створок клапана слоем фибробластов и эндотелиальных клеток защищает внеклеточный матрикс от воздействия факторов реципиента и задерживает дегенеративные изменения ксеноматериала [16—18]. Дальнейшее развитие представленного направления имеет стратегическое значение в создании более совершенных моделей имплантируемых устройств для клапанного протезирования [19, 20].

Заключение

Согласно полученным данным, инфицирование девитализированной ткани БП происходит на фоне их заселения клетками реципиента. При этом в БП параллельно протекают два разнонаправленных процесса — разрушение внеклеточного матрикса при участии возбудителей инфекционного процесса и макрофагов наряду с его структурной регенерацией, ассоциированной с активностью фибробластов и ГМК. Конечный результат этих процессов зависит от агрессивности присутствующего возбудителя инфекции и выраженности проявлений местного и ситемного воспалительного ответа.

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546−2015−0011 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.С.Б., Р.А.М., Н.В.Р., А.Г.К.

Сбор и обработка данных — Р.А.М., Н.В.Р., И.В.М., О.Д.С.

Написание текста — Р.А.М., Н.В.Р., И.В.М., А.Г.К.

Редактирование — Л.С.Б., Ю.А.К., А.Г.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Мухамадияров Р.А. — https://orcid.org/0000-0002-5558-3229; e-mail: rem57@rambler.ru

Рутковская Н.В. — https://orcid.org/0000-0002-8829-0481

Мильто И.В. — https://orcid.org/0000-0002-9764-4392

Сидорова О.Д. — https://orcid.org/0000-0003-2731-6294

Барбараш Л.С. — https://orcid.org/0000-0001-6981-9661

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Мухамадияров Р.А., Рутковская Н.В., Мильто И.В., Сидорова О.Д., Барбараш Л.С. Клеточный состав эксплантированных биопротезов клапанов сердца при инфекционном эндокардите. Архив патологии. 2019;81(6):-23. https://doi.org/10.17116/patol201981061

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail