Тимошенко О.С.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Гуреева Т.А.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Кугаевская Е.В.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Андреева Ю.Ю.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Соловьева Н.И.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Желатиназы А и В и их эндогенные регуляторы в теле матки при плоскоклеточной карциноме шейки матки

Журнал: Архив патологии. 2018;80(6): 22-28

Просмотров : 83

Загрузок : 3

Как цитировать

Тимошенко О. С., Гуреева Т. А., Кугаевская Е. В., Завалишина Л. Э., Андреева Ю. Ю., Соловьева Н. И. Желатиназы А и В и их эндогенные регуляторы в теле матки при плоскоклеточной карциноме шейки матки. Архив патологии. 2018;80(6):22-28. https://doi.org/10.17116/patol20188006122

Авторы:

Тимошенко О.С.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Все авторы (6)

Желатиназы, А и В являются матриксными металлопротеиназами (ММП) — ММП 2, ММП 9, которые относятся к семейству цинковых кальций-зависимых металлопротеиназ. Функции этих ферментов связаны с метаболизмом белков соединительнотканного матрикса (СТМ) [1—4]. Желатиназы выполняют как деструктивные, так и регуляторные функции. Они гидролизуют коллаген IV типа — основу базальных мембран, а ММП 2 способна гидролизовать фибриллярные коллагены I и III типов. При этом происходит не только деструкция мембраны, но и высвобождение из нее эндотелиальных клеток, способных мигрировать и принимать участие в ангиогенезе, процессе, который наряду с деструкцией играет основную роль в прогрессии опухолей [4]. Желатиназы гидролизуют и другие компоненты СТМ, такие как эластин, аггрекан, адгезивные молекулы — ламинин, фибронектин, витронектин и др., а также модифицируют свойства и высвобождают из СТМ ряд биологически активных молекул, таких как факторы роста, цитокины и др., которые отвечают за регуляцию сигнальных путей, контролирующих процессы инвазии и ангиогенеза [4, 5]. ММП 9 считают основным «включателем» высвобождения из СТМ эндотелиального фактора роста (VEGF), который является основным индуктором ангиогенеза [4]. ММП 2 относится к конститутивным ферментам и может экспрессироваться в тканях независимо от индуцирующих агентов. ММП 9 является индуцируемым ферментом, экспрессия которого в нормальных тканях находится на очень низком уровне или отсутствует. Экспрессия его в ткани находится под контролем сигнальных путей и зависит от целого ряда агентов, индуцирующих экспрессию ММП, в частности онкогенов. Кроме того, экспрессия ММП в прилегающей к опухоли ткани стимулируется индуктором экспрессии ММП (EMMPRIN), находящимся на поверхности опухолевых клеток [6]. Активность ММП 2 и ММП 9 на посттрансляционном уровне зависит от наличия их тканевых активаторов и ингибиторов (ТИМП). Активатором ММП 9 является плазмин, который образуется в результате активации плазминогена с помощью уАП. Зимогены этих ММП могут обладать частичной активностью в результате их ступенчатой активации с участием активных форм ММП [2, 4, 5]. Основным игибитором ММП 2 и ММП 9 является ТИМП 2, который наряду с ММП 14 принимает участие в активации про-ММП 2.

Итак, ММП 2 и ММП 9 в результате ограниченного протеолиза высвобождают ряд биологически активных молекул, которые участвуют в регуляции сигнальных путей и способствуют экспрессии ММП как в опухоли, так и в нормальной ткани. В ряде случаев наблюдается высокая экспрессия ММП не только в опухоли, но и в строме и СТМ, причем на достаточно высоком уровне, иногда превосходящем опухолевую ткань [7, 8]. Это приводит к генерализации онкологического процесса.

Настоящее исследование посвящено изучению особенностей экспрессии важнейших ферментов инвазии, деструкции и ангиогенеза — желатиназ (ММП 2 и ММП 9) и их эндогенных регуляторов (ТИМП 2 и уАП) при плоскоклеточной карциноме шейки матки (ПКШМ) в теле матки, которое отличается по морфологическому строению от шейки матки. Рак шейки матки занимает второе место после рака молочной железы по частоте заболеваемости и смертности у женщин. Этиологическими факторами возникновения рака шейки матки служат вирусы папиллом (HPV) высокого риска, среди которых вирусы HPV16 и HPV18 являются наиболее распространенными и агрессивными [9]. Основные работы по исследованию экспрессии ММП проведены на клетках и клеточных линиях [10, 11]. В случае ПКШМ установлена корреляция экспрессии ММП 2 и ММП 9 в тканях опухоли и плазме крови со стадией заболевания, степенью дифференцировки, васкуляризацией и метастазированием в лимфатические узлы [12], а также получены данные об увеличении экспрессии этих ферментов и ТИМП-2 [13]. Данные, касающиеся экспрессии ММП и ингибиторов в морфологически нормальной ткани, окружающей опухоль, единичны. Есть работа, указывающая на то, что при ПКШМ стромальные клетки могут увеличивать прогрессию опухоли с помощью ММП 2 [7, 14]. По предварительным данным, полученным нами, наблюдается достаточно высокий уровень экспрессии ММП как в опухолевой, так и в нормальной, прилегающей к опухоли ткани [14].

Цель настоящего исследования — выяснение особенностей экспрессии ММП 2, ММП 9, их тканевого ингибитора ТИМП 2 и активатора про-ММП 9 уАП (через плазмин) в теле матки при ПКШМ. Эти сравнительные исследования позволяют оценить потенциал важнейших факторов инвазии, уровень их экспрессии и деструктивной активности в опухолевой и нормальной ткани матки, отличающейся по структуре от ткани шейки матки и находящейся вне зоны рака шейки матки. Подобные исследования ставят вопрос о дистанционной передаче сигналов в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей, например по эпителиально-мезенхимальному типу, с участием Hedgehog (Hh)-сигналинга и его роли в активации ММП.

Материал и методы

Клинический материал

В работе использован операционный материал, полученный после экстирпации матки у пациенток с диагнозом ПКШМ, получавших лечение в Московском научно-исследовательском онкологическом институте (МНИОИ) им. П.А. Герцена в 2010—2013 гг. Материал получен в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена. Согласие на использование материала для научных исследований получено от всех пациенток. Исследования проводили в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинкской декларации. В работе использовали образцы ПШКМ и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани и тканевые «ленты», взятые на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки, которые были разделены на фрагменты, заморожены немедленно и хранились в жидком азоте. Все случаи классифицированы по TNM клинической классификации опухолей в соответствии с требованиями Международного союза по борьбе с раком (UICC). Ткани были гистологически идентифицированы в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена. Все образцы карцином экспрессировали ген Е7 HPV16.

Иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию проводили по стандартному методу [16] с некоторыми модификациями. Послеоперационный материал фиксировали 10% раствором нейтрального формалина в течение 24 ч, затем обезвоживали и пропитывали парафином в автоматизированном режиме в аппарате STP120. Срезы толщиной 4 мкм готовили на высокоадгезивных стеклах. Депарафинирование проводили по стандартной технологии. Восстановление антигенной активности проводили при температуре 97 °C в течение 20 мин в цитратном буфере (рН 6,0) или в стандартном ЭДТА-буфере, содержащем трис-HCl (рН 8,0), для соответствующих антител. Использовали моноклональные антитела к ММР 2, MMP 9 и TИМП-2 фирмы «LabVision» в готовом разведении. ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногистостейнере Avtosteiner («Dako», Дания). В качестве детекционной системы использовали систему Envision («Dako», Дания), в качестве хромогена — 3,3’-диаминобензидин. Затем срезы докрашивали гематоксилином. Микроскопирование проводили на микроскопе Leica Q 550 («Leica Microsystems», Германия). Учитывая выраженность реакции и ее локализацию, интенсивность реакции оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — сильная реакция.

Исследование экспрессии генов ММП 2, ММП 9, уАП и ТИМП 2 проводили методом полуколичественной ОT-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, Z 3100). Нормировку результатов осуществляли по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) и HPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы). В работе были использованы следующие праймеры (см. таблицу).

Праймеры, использованные в ОT-ПЦР

Для подбора специфических праймеров использованы данные GeneBank Nucleotide Sequence Database. Для оценки структуры праймеров применяли компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Продукты ОТ-ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле, содержащем бромид этидия 0,5 мкг/мл.

Методом зимографии определяли активность и спектр ММП 2 и ММП 9. Зимографию с сополимеризованным желатином проводили по модифицированному методу, описанному в работе [16]. Концентрация верхнего (концентрирующего) геля составляла 4%, нижнего (разделяющего) — 7,5%, концентрация желатина — 1,5 мг/мл. Пробы наносили из расчeта 50 мкг белка на лунку. Электрофоретический анализ проводили при температуре 9 °C в течение 1,5 ч. Гель промывали (3 раза по 30 мин) в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ СаСl2, 2,5% тритон Х-100, после чего инкубировали в течение 20 ч при температуре 37 °C в этом же буферном растворе, но с пониженной до 1% концентрацией тритона Х-100. После инкубации гель фиксировали в смеси изопропанол : уксусная кислота : вода (5:2:13), окрашивали в течение 30 мин 0,1% Кумасси R 250 и отмывали в растворе изопропанол: уксусная кислота: вода (2:1:17). Денситометрический анализ зимограммы проводили с использованием программы ImageJ.

Определение активности активатора плазминогена (уАП)

Активность уАП определяли по гидролизу Z-Gly-Gly-Arg-MCA [18]. Реакцию проводили в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,8. Опытная проба объемом 500 мкл содержала 20 мкг белка лизата, 20 мкл раствора субстрата (в конечной концентрации 4.10-5 М). Гидролиз проводили при 37 °С в течение 5—20 мин, реакцию останавливали добавлением 0,05 М Na-ацетатного буфера рН 4,0. Флюоресценцию образовавшегося продукта гидролиза метилкумариламина (МСА) измеряли при длинах волн: 370 нМ (возбуждение) и 460 нМ (излучение). Активность выражали в пкМ продукта, высвобожденного за 1 мин в расчете на 1 мг белка.

Результаты и обсуждение

Исследование спектра и активности ММП 2 и ММП 9 методом зимографии проводили на 8 тканевых «лентах», полученных при экстирпации матки при ПКШМ, образцы от стенки влагалища до дна полости матки были разделили на фрагменты длиной около 1 см и содержали от 4 до 6 фрагментов.

На рис. 1 представлены

Рис. 1. Анализ желатиназной активности ММП 2 и ММП 9 в двух типичных тканевых «лентах». а, б — анализ желатиназной активности ММП 2 и ММП 9 с помощью метода зимографии; А1, Б1 — денситометрический анализ зимограммы с использованием программы ImageJ.
данные зимографии типичных экспериментов, проведенных на двух тканевых «лентах» А и Б, состоящих из 6 фрагментов. Во фрагментах «ленты» А, содержащих ПКШМ (1—3), наблюдалась высокая активность ММП 9, однако экспрессия ММП 9 происходила и в ткани матки, где в нормальных условиях она отсутствует, при этом уровень ее экспрессии был в 2—3 раза ниже, чем в опухоли. Форма зимогена про-ММП 9 отсутствовала (рис. 1, а, А1). Активность ММП 2 была существенно ниже, чем ММП 9, и равномерно выражена по всей длине «ленты» (исключение — фрагмент 3), а форма про-ММП 2 была в 3—4 раза выше в ПКШМ, чем во фрагментах тела матки (см. рис. 1, а, А1). Полученные данные свидетельствуют о том, что при ПКШМ высокая экспрессия конститутивного фермента ММП 2 и индуцируемого фермента ММП 9 происходит не только в опухоли, но и в нормальной ткани матки, что способствует развитию инвазивного процесса. Экспрессия ММП 9 может индуцироваться в теле матки, где в нормальных условиях она отсутствует. ММП 9 может служить маркером инвазивного процесса. Во фрагментах «ленты» Б активность ММП 9 наблюдалась только во фрагментах ПКШМ (1—3), а в случае про-ММП 9 находилась на очень низком уровне (см. рис. 1, б, Б1). Активность ММП 9 в нормальной ткани матки отсутствовала. Активность ММП 2 и про-ММП 2 находились на высоком уровне по всей длине тканевой «ленты». Однако уровень этих форм ММП 2 был различен. В опухоли уровень про-ММП 2 в 3—4 раза выше, чем во фрагментах нормальной ткани, где активность ММП 2 равномерно высокая, сопоставимая с уровнем активности в опухоли, и значительно превосходила уровень про-ММП 2 (см. рис. 1, б, Б1). Полученные данные свидетельствуют о том, что регуляция экспрессии ММП 2 и ММП 9 как факторов инвазии в различных ПКШМ существенно различается и может иметь прогностическое значение, для чего важно определять уровень ММП не только в опухоли, но и в окружающей опухоль нормальной ткани. Нарушение регуляции экспрессии этих ферментов происходит не только на генном, но и на посттрансляционном уровне, а их повышенная экспрессия направлена на развитие инвазивного потенциала. Функции ММП 2 и ММП 9 в тканях, по-видимому, различны.

Исследование экспрессии генов ММП 2, ММП 9, их тканевого ингибитора ТИМП 2 и активатора уАП также проводили на тканевых «лентах». На рис. 2 представлены

Рис. 2. Экспрессия мРНК ММП 2, ММП 9, уАП и ТИМП-2 в тканевых «лентах» на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки.
результаты экспрессии генов на примере «ленты», состоящей из 4 фрагментов, которые отражают общий принцип экспрессии генов в опухолевых и нормальных тканях. Экспрессия ММП 9 ярко выражена только в опухолевых образцах (фрагменты 1—2), а в нормальной ткани (фрагменты 3—4) экспрессия очень слабая. Экспрессия генов ММП 2 происходит как в образцах, содержащих опухоль (1—2), так и в нормальной ткани (3—4). Данные по экспрессии ММП 2 и ММП 9 согласуются с результатами, полученными методом зимографии. Экспрессия регулятора активности ММП 9 уАП в опухолевой ткани была наиболее выраженной (фрагменты 1—2). Экспрессия ТИМП-2 была равномерной и достаточно выраженной по всей длине «ленты». Следует учесть, что ТИМП 2 не только обладает функцией ингибитора, но и в комплексе с мембраносвязанной металлопротеиназой ММП 14 принимает участие в активации ММП 2. Соответственно высокая экспрессия ТИМП 2 наряду с высокой экспрессией ММП 14 направлена на увеличение протеолитического потенциала и опухолевой и морфологически нормальной ткани.

Исследование экспрессии уАП — активатора ММП 9 проведено на 6 тканевых «лентах». Полученные данные свидетельствуют о том, что активность фермента находилась на достаточно высоком уровне во всех образцах как опухолевой, так и нормальной ткани до дна полости матки (рис. 3).

Рис. 3. Активность активатора плазминогена (уАП) в тканевых «лентах».
В большинстве образцов в опухолевых фрагментах активность уАП наиболее выражена (1—4). В 2 (5,6) случаях активность уАП выше в нормальных образцах, что может иметь прогностическое значение. Высокая активность уАП характеризует высокую потенциальную возможность проявления ферментативной активности ММП, кроме того, уАП как сериновая протеиназа может участвовать в деградации тканей, усиливая деструктивный потенциал опухоли.

Исследование уровня экспрессии ММП 2, ММП 9 и их тканевого ингибитора ТИМП-2 проведено ИГХ-методом на образцах ПКШМ и морфологически нормальных тканей, залитых в парафин. На рис. 4 представлены

Рис. 4. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ММП 2, ММП 9 и ТИМП 2 во фрагментах образцов плоскоклеточной карциномы шейки матки и морфологически нормальных тканей, ×400.
типичные примеры ИГХ-реакции с соответствующими антителами к ферментам и ингибитору. Оценку результатов проводили по интенсивности реакции полуколичественным методом по 3-балльной шкале (от 0 до 3 баллов).

ИГХ-исследование экспрессии ММП 2 (см. рис. 4) показало наличие яркой положительной реакции (2—3 балла) в клетках опухоли (см. рис. 4, образцы 1—3). В строме опухоли и морфологически нормальной ткани положительная реакция была достаточно выражена (см. рис. 4, фрагмент 4 с отсутствием опухоли). Для экспрессии ММП 9 характерно наличие выраженной позитивной реакции (2—3 балла) и в клетках опухоли и строме, при этом более выраженная интенсивность реакции отмечена в опухоли по сравнению со стромой. Во фрагментах образцов, где опухоль отсутствовала, наблюдалось окрашивание меньшей интенсивности, чем в опухоли (см. рис. 4, фрагмент 4). ТИМП 2 иммуногистохимически был выявлен не во всех образцах как в опухоли, так и в строме. Распределение выявленной на образцах, залитых в парафин, ИГХ-экспрессии ММП 2, ММП 9 в целом совпадает с данными, касающимися экспрессии генов и ферментативной активности, полученными на замороженном материале тканевых «лент». Исключение составляют данные по экспрессии ТИМП 2, которые в случае ИГХ-исследований на образцах, залитых в парафин, также согласуются с результатами по генной экспрессии. Однако, как правило, по данным, полученным ранее, в тканевых «лентах» [17] обнаруживали слабое присутствие или отсутствие ТИМП 2, а данные ОТ-ПЦР свидетельствовали о выраженном наличии ТИМП 2 в тех же образцах. Это расхождение в результатах только за счет чувствительности методов в настоящее время объяснить достоверно не представляется возможным. Подобные расхождения отмечают и другие авторы [18].

Полученные данные по экспрессии ММП 2 и ММП 9 в теле матки при ПКШМ в основном согласуются с результатами наших ранних исследований экспрессии этих ферментов в фибробластах, трансформированных Е7-онкогеном HPV16 [19], а также на коммерческих клеточных линиях ПКШМ [20] и на клиническом материале [20]. Полученные в этих работах результаты свидетельствуют о том, что основной вклад в инвазивный (деструктивный) потенциал ПКШМ вносят высокая экспрессия ММП 9 и активность ММП 2, изменяющаяся в меньшей степени, но находящаяся на достаточно высоком уровне. Экспрессия ТИМП 2, исследованная с помощью ИГХ-метода, была на низком уровне или отсутствовала. ТИМП 2 выполняет двойную функцию. Он не только ингибирует ММП, но и принимает участие в активации зимогена про-ММП 2. В морфологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли, также обнаружена экспрессия ММП 2 и ММП 9, которая вносит дополнительный вклад в инвазивный потенциал опухоли. Данные по экспрессии ММП 2 и ММП 9 в тканях, имеющиеся в литературе, достаточно противоречивы. Некоторые исследователи показали отсутствие корреляции в развитии инвазивного процесса и метастазов с экспрессией ММП 2 и ТИМП 2. Другие авторы обнаружили высокую экспрессию ММП 9 и ММП 2 в тканях карцином шейки матки разной степени дифференцировки [12, 13, 18].

Заключение

Экспрессия желатиназ ММП 2, ММП 9 и регуляторов их активности направлена на увеличение деструктивного (инвазивный) потенциала опухоли и может происходить (индуцироваться) в нормальной ткани тела матки, морфологически отличающейся от ткани шейки матки, по-видимому, с участием сигналинга по эпителиально-мезенхимальному типу взаимодействия. Индуцируемая в теле матки ММП 9 может служить маркером инвазивного потенциала. Экспрессия ММП 2 и ММП 9 как факторов инвазии в различных случаях ПКШМ может существенно различаться и иметь прогностическое значение, поэтому важно определять уровень ММП не только в опухоли, но и в окружающей опухоль нормальной ткани. Нарушение регуляции экспрессии этих ферментов происходит не только на генном, но и на посттрансляционном уровне, а их повышенная экспрессия направлена на развитие инвазивного потенциала. Данные указывают на различные функции ММП 2 и ММП 9 в тканях. Они важны для понимания роли желатиназ ММП 2, ММП 9 в процессе канцерогенеза, могут иметь прогностическое значение и влиять на терапевтическую стратегию в отношении пациента.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка материала — О.С.Т., Т.А.Г. Е.В.К., Л.Э.З.

Статистическая обработка данных — О.С.Т., Т.А.Г., Е.В.К.

Написание текста — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З.

Редактирование — Н.И.С., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Соловьева Нина Ивановна — e-mail: Nina.Solovyeva@ibmc.msk.ru; https://orcid.org//0000-0002-6254-8528

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail