Тканевая коллагеназа ММП-14 и эндогенные регуляторы ее активности в теле матки при плоскоклеточной карциноме шейки матки

Читать метаданные

Цель исследования — изучение особенностей экспрессии мембраносвязанной матриксной металлопротеиназы — МТ1-ММП (ММП-14), ее тканевого ингибитора ТИМП-2 и активатора проММП-14 — фурина в теле матки от стенки влагалища до дна полости матки при плоскоклеточной карциноме шейки матки (ПКШМ). Материал и методы. Исследование проводили на операционном материале, полученном после экстирпации матки у пациенток при ПКШМ. Использованы ОТ-ПЦР, иммуногистохимический (ИГХ) и энзиматический методы. Результаты. Установлено, что при ПКШМ наблюдается повышенная экспрессия ММП-14 в клетках опухоли по данным как ИГХ (+3), так и ОТ-ПЦР. В нормальных тканях матки (эндометрий и миометрий) экспрессия ММП-14 по результатам ИГХ отсутствовала либо была выражена слабо. Однако экспрессия мРНК ММП-14 обнаружена и в нормальных тканях до дна полости матки. Активность фурина в опухоли значительно превышала его активность в нормальной ткани. По данным ИГХ экспрессия ТИМП-2 находилась на низком уровне или отсутствовала как в опухоли, так и в нормальных тканях. Экспрессия мРНК ТИМП-2 была достаточно выражена как в опухолевой ткани, так и в нормальных тканях до дна полости матки. Заключение. При ПКШМ происходит значительное увеличение экспрессии ММП-14 в опухоли. Экспрессия ММП-14 и регуляторов ее активности направлена на увеличение деструктивного (инвазивного) потенциала опухоли в перицеллюлярном пространстве и может происходить (индуцироваться) в морфологически нормальной ткани тела матки, по-видимому, с участием сигналинга по эпителиально-мезенхимальному типу взаимодействия. Данные важны для понимания роли ММП-14 в развитии многоступенчатого процесса канцерогенеза, могут иметь прогностическое значение и влиять на терапевтическую стратегию в отношении пациенток.

Ключевые слова:

тканевая коллагеназа ММП-14

тканевый ингибитор ММП-14 ТИМП-2

фурин

плоскоклеточная карцинома шейки матки

Авторы:

Тимошенко О.С.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Гуреева Т.А.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Кугаевская Е.В.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Андреева Ю.Ю.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

SPIN РИНЦ: 6504-2551
ORCID: 0000-0003-4749-6608

Соловьева Н.И.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАН

Закрыть метаданные

Тканевая коллагеназа — ММП-14, или МТ1-ММП, относится к матриксным металлопротеиназам (ММП), функция которых связана с деградацией соединительнотканного матрикса (СТМ). В тканях человека известно 25 ММП [1—3], из которых 19 являются секретируемыми, а 6 — мембраносвязанными (МТ-ММП) [4]. Наиболее исследованной является МТ1-ММП, или ММП-14 [4, 5], которая относится к подсемейству тканевых коллагеназ и по ферментативным свойствам близка секретируемой ММП-1 [1, 4, 6, 7]. ММП-14 обладает широкой субстратной специфичностью, выполняет как деструктивные, так и регуляторные функции. ММП-14 гидролизует основные компоненты СТМ, в частности фибриллярные коллагены I, II, III, но не гидролизует коллаген IV типа — основу базальных мембран [1, 4, 8]. С помощью ограниченного протеолиза ММП-14 участвует в регуляции активности биологически активных молекул: проММП-2, проММП-13, α₁-протеиназный ингибитор, и др. [1, 4]. Механизм активации проММП-13 при участии ММП-14 неизвестен [9]. МТ-ММП синтезируются в виде предшественников, активация которых происходит в аппарате Гольджи с помощью сериновой протеиназы фурина и фуриноподобных протеинконвертаз [4, 10]. Известны 4 тканевых ингибитора ММП — ТИМП-1, ТИМП-2, ТИМП-3, ТИМП-4. Они обладают избирательной специфичностью в отношении различных ММП. Основным ингибитором ММП-14 является ТИМП-2, который принимает участие как в активации проММП-2, так и ингибировании ММП-14 [4, 11]. Фермент считается промотирующим фактором в развитии инвазивного процесса, поскольку он локализован в перицеллюлярном пространстве и способен гидролизовать непосредственно фибриллярные коллагены и косвенно, через ММП-2, коллагены базальных мембран [4, 12, 13].

Данные по участию ММП-14 в развитии рака шейки матки на клиническом материале незначительны. Они свидетельствуют, что экспрессия ММП-14 коррелирует с инвазивными свойствами опухоли, промотирует ангиогенез, является неблагоприятным прогностическим фактором [12—15]. Коэкспрессия опухолью ТИМП-2 и ММП-2 с ММП-14 также коррелирует с неблагоприятным прогнозом [4, 16]. Полученные нами данные по экспрессии ММП на образцах ПКШМ и морфологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли, свидетельствуют, что основной вклад в деструктивный (инвазивный) потенциал карцином вносит увеличение экспрессии ММП-1 и ММП-9 и в меньшей степени изменение экспрессии ММП-2. Экспрессия ТИМП-1 и ТИМП-2 находилась на низком уровне. В прилегающей к опухоли нормальной ткани обнаружена существенная экспрессия ММП-1, ММП-2, ММП-9, что может способствовать увеличению деструктивного потенциала опухоли [15, 17, 18]. Исследование экспрессии ММП-14 и ее активатора фурина в образцах ПКМШ и прилегающей к опухоли нормальной ткани показало, что экспрессия ММП-14 и фурина в опухоли существенно увеличена по сравнению с нормой [15, 18]. В настоящем исследовании предполагается выяснить может ли влиять карцинома шейки матки на экспрессию ММП и их регуляторов на все тело матки, которое имеет свои особенности морфологического строения, отличные от шейки матки.

Материал и методы

В работе был использован операционный материал, полученный после экстирпации матки у пациенток с диагнозом плоскоклеточной карциномы шейки матки (ПКШМ) II—III стадии. Возраст пациенток колебался от 38 до 59 лет. Материал получен в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена. Согласие на использование материала для научных исследований дали все пациентки. Исследования проводили согласно принципам, обозначенным в Хельсинкской декларации. В работе использованы тканевые «ленты», взятые на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки, которые были разделены на фрагменты, заморожены немедленно и хранились в жидком азоте. Все случаи классифицированы по TNM-клинической классификации опухолей согласно требованиям Международного союза по борьбе с раком (UICC). Ткани были гистологически идентифицированы в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена (табл. 1).

Таблица 1. Наличие опухоли в образцах тканевых «лент» по данным гистологического исследования препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином Примечание. + — наличие опухоли; – — отсутствие опухоли.

Иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию проводили по стандартному методу [16, 17] с некоторыми модификациями. В работе использовали замороженные срезы толщиной 5 мкм, которые готовили по стандартной методике на криостате Leica CM 1510S и монтировали на высокоадгезивных стеклах. Затем срезы фиксировали 10% нейтральным формалином 15 мин при комнатной температуре. Восстановление антигенной активности проводили в модуле предобработки автостейнера при температуре 97 °С в течение 20 мин в цитратном буфере рН 6,0 или в стандартном трис-ЭДТА-буфере рН 9,0 для соответствующих антител. Использовали моноклональные антитела к ММР-14 и TИМП-2 фирмы «LabVision» в готовом разведении. ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногистостейнере Avtosteiner («Dako»). В качестве детекционной системы использовали систему Envision («Dako»), в качестве хромогена — диаминобензидин. Затем срезы докрашивали гематоксилином. Микроскопирование проводили на анализаторе изображения Leika Q 550. Интенсивность реакции оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — сильная реакция.

Исследование экспрессии генов ММП-14 и ТИМП-2 проводили методом полуколичественной ОT-ПЦР [15, 18]. Выделение РНК проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, Z 3100). Нормирование результатов осуществляли по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) и HPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы). В работе были использованы следующие праймеры: МТ1-ММП, прямой — 5’ CCT TTT ACC AGT GGA TGG AC 3’, обратный — 5’ CCA GCT CCT TAA TGT GCT TG 3’ (444 н. п, 29 циклов, 40 с); ТИМП-2, прямой праймер — 5’ GGT CTC GCT GGA CGT TGG AG 3’, обратный — 5’ GGA GCC GTC ACT TCT CTT G 3’ (304 н.п., 58 °C, 27 циклов, 30 с); GAPDH, прямой праймер — 5’ ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’, обратный — 5’ TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’ (450 п.н., 60 °C, 28 циклов, 30 с); HPRT, прямой праймер — 5’ CTG GAT TAC ATC AAA GCA CTG 3’, обратный — 5’ GGA TTA TAC TGC CTG ACC AAG 3’ (230 п.н., 60 °C, 30 циклов, 30 с). Для подбора специфических праймеров использовали данные GeneBank Nucleotide Sequence Database. Для оценки структуры праймеров использовали компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Продукты ОТ-ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле, содержащем бромид этидия 0,5 мкг/мл [18].

Активность фурина определяли по гидролизу флюорогенного субстрата Pyr-Arg-Tre-Lys-Arg-MCA [15]. Опытная проба объемом 500 мкл содержала 5—15 мкг белка лизата, субстрат в конечной концентрации 3·10^–4 М, 0,1 М трис-HCl-буфер рН 7,0, содержащий 1 мМ СаCl₂. Гидролиз проводили при 37 °C в течение 10—20 мин. Реакцию останавливали внесением 5 мМ раствора ЭДТА. Флюоресценцию продукта реакции — метилкумариламина (МСА) измеряли при длинах волн 370 нм (возбуждение) и 460 нм (излучение). Активность выражали в пкмоль продукта, освобожденного за 1 мин на 1 мг белка. Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента для малых выборок. Данные представлены как среднее значение ± средняя квадратичная ошибка (M±m). В табл. 2 представлены

Таблица 2. Активность фурина в образцах тканевых «лент» Примечание. н/o — наличие (+) или отсутствие (–) опухолевой ткани во фрагменте лент.

средние значения активности фурина по результатам трех опытов.

Результаты и обсуждение

Исследование экспрессии ММП-14, активатора ее профермента (проММП-14) фурина и эндогенного ингибитора ТИМП-2 проводили на 8 тканевых «лентах», полученных при экстирпации матки при ПКШМ, расположенных на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки, которые были разделены на фрагменты длиной 1 см. Оценку результатов проводили по интенсивности реакции по 3-балльной шкале (от 0 до 3 баллов).

ИГХ-исследование экспрессии ММП-14 и ТИМП-2 с использованием соответствующих антител к ММП-14 и ТИМР-2 в характерных образцах двух тканевых «лент», состоящих из 6 фрагментов, представлены на рис. 1, 2.

Рис. 1. Экспрессия ММП-14 в «лентах» от стенки влагалища до дна полости матки. а — «лента» 1; б — «лента» 2. ИГХ, ×400. (Объяснение в тексте).

Рис. 2. Экспрессия ТИМП-2. а — в «лентах» от стенки влагалища до дна полости матки; б — в отдельных образцах ПКШМ. ИГХ, ×400. (Объяснение в тексте).

На рис. 1 представлены данные по экспрессии ММП-14 в двух тканевых «лентах». В обеих «лентах» ярко выраженная экспрессия ММП-14 обнаружена во фрагментах, содержащих опухолевую ткань: в первой «ленте» (+3 балла) в 1—5 фрагментах (рис. 1, а), во второй «ленте» (+2, +3 балла) в 1—3 фрагментах (см. рис. 1, б) и не обнаружена во фрагментах, где опухоль отсутствовала. Следует подчеркнуть, что ММП-14 относится к мембраносвязанным ММП, следовательно, ее экспрессия происходит на поверхности клетки, где она и определяется, что имеет место в наших исследованиях. На рис. 2, а представлены данные по экспрессии ТИМП-2 в «ленте», состоящей из 6 фрагментов, где опухоль находилась в 1—3 фрагментах. ИГХ-реакция отсутствует по всей длине ленты. Повышенная экспрессия ММП-14 и низкая экспрессия (или ее отсутствие) ТИМП-2 приводят к увеличению активности ММП-14. Фермент считается промотирующим фактором в развитии инвазивного процесса [12, 13, 19]. Повышенный уровень экспрессии ММП-14 при ПКШМ может рассматриваться как фактор плохого прогноза. Экспрессия ММП-14 и регуляторов ее активности может происходить (индуцироваться) и в морфологически нормальной ткани матки, по-видимому, по типу эпителиально-мезенхимального взаимодействия [15, 18]. Данные, полученные нами на отдельных образцах опухолей, свидетельствуют, что в опухолях наблюдается как выраженная экспрессия ТИМП-2 (см. рис. 2, б, 1—3), так и отсутствие его экспрессии (см. рис. 2, б, 4). Наши данные согласуются с данными ряда авторов об экспрессии ММП-14 при ПКШМ [4, 13, 14].

Исследование экспрессии генов ММП-14 проведено на 8 тканевых «лентах». На рис. 3 представлены

Рис. 3. Экспрессия мРНК ММП-14 (а) и ТИМП-2 (б) в тканевых «лентах» на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки.

данные по экспрессии генов в тех же двух «лентах», в которых проводилась ИГХ-реакция. В первой «ленте» (рис. 3, а) выраженная экспрессия мРНК ММП-14 обнаружена в 1—4 фрагментах, где присутствует опухоль, в 5-м она выражена слабо, а в 6-м фрагменте, где опухоль отсутствует, не обнаружена. Во второй «ленте» экспрессия мРНК ММП-14 была выражена слабее, чем в первой «ленте». Более выраженная экспрессия наблюдалась в 1 фрагменте, где находилась опухоль, и в 4—6 фрагментах, где опухоль отсутствовала (см. рис. 3, б). Полученные результаты свидетельствуют, что экспрессия генов ММП-14 может происходить как в опухолевой, так и в нормальной ткани матки до ее дна. Исследование экспрессии генов ТИМП-2 показало, что экспрессия мРНК ТИМП-2 выражена достаточно равномерно в 1—5 фрагментах первой «ленты», в которых присутствует опухоль (см. рис. 3, а). Во второй «ленте», где опухоль находилась в 1—3 фрагментах (см. рис. 3, б), наблюдалась неравномерная экспрессия мРНК ТИМП-2 по всей ее длине. Выраженная экспрессия ингибитора наблюдалась как в отдельных фрагментах опухоли, так и в нормальной ткани. От соотношения количества фермента ММП-14 и ингибитора ТИМП-2 в ткани зависит проявление активности фермента. Данные по экспрессии мРНК ТИМП-2 свидетельствуют о достаточно равнозначной экспрессии ингибитора как в опухоли, так и в нормальных тканях, что позволяет ферменту проявлять повышенную активность, приводящую к развитию процесса деструкции (инвазии). Представленные данные согласуются с результатами, полученными нами ранее на образцах ПКШМ и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани [15, 18], а также с результатами ряда авторов об экспрессии ММП-14 и ее регуляторов при ПКШМ [4, 12—14, 19]. Причины расхождения в результатах, полученных с помощью ИГХ-реакции (белок) и более чувствительного метода ОТ-ПЦР (мРНК), в настоящее время достоверно объяснить трудно. Это отмечают и другие авторы [4, 16].

Исследование активности активатора проММП-14 фурина, проведенное на 8 тканевых «лентах», показало, что активность фермента наиболее выражена в опухоли и колеблется от 50 до 1890 пкМ/мг/мин. В нормальных тканях матки экспрессия фурина была значительно ниже, где ее колебания были в пределах от 29 до 260 пкМ/мг/мин. Высокая активность фурина может способствовать активации проММП-14 и, следовательно, развитию деструктивного процесса [10].

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют, что при ПКШМ наблюдалась повышенная экспрессия ММП-14 в опухоли как по данным ИГХ, так и ОТ-ПЦР. В морфологически нормальной ткани экспрессия ММП-14 по результатам ИГХ либо отсутствовала, либо была выражена слабо, в то время как по данным ОТ-ПЦР мРНК экспрессия ММП-14 обнаружена как в опухоли, так и в нормальных тканях до дна полости матки. Экспрессия ТИМП-2 по данным ИГХ находилась на низком уровне или отсутствовала, в то время как по данным ОТ-ПЦР экспрессия мРНК ТИМП-2 была достаточно выражена как в опухолевой, так и в нормальных тканях до дна полости матки. Следовательно, экспрессия ММП-14 и регуляторов ее активности при ПКШМ направлена на увеличение деструктивного (инвазивного) потенциала опухоли в перицеллюлярном пространстве и может происходить в морфологически нормальных тканях матки. Данные важны для понимания механизма развития деструктивного процесса как в шейке матки, так и в теле матки при ПКШМ, имеют прогностическое значение, и предполагают участие в процессе экспрессии ММП сигналинга по типу эпителиально-мезенхимального взаимодействия.

Работа выполнена в рамках «Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 годы».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З., Ю.Ю.А

Сбор и обработка материалов: О.С.Т., Е.В.К., Т.А.Г., Л.Э.З

Статистическая обработка данных: О.С.Т., Е.В.К., Т.А.Г.

Написание текста: Н.И.С., О.С.Т., Е.В.К., Л.Э.З.

Редактирование: Н.И.С., Л.Э.З., Ю.Ю.А

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.