Заднипряный И.В.

Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия

Третьякова О.С.

Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия

Сатаева Т.П.

Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Республика Крым, Россия, 295006

Исследование антиоксидантной активности и кардиопротекторного эффекта реамберина и цитофлавина в условиях гемической гипоксии у новорожденных крысят

Журнал: Архив патологии. 2015;77(6): 39-44

Просмотров : 7

Загрузок :

Как цитировать

Заднипряный И. В., Третьякова О. С., Сатаева Т. П. Исследование антиоксидантной активности и кардиопротекторного эффекта реамберина и цитофлавина в условиях гемической гипоксии у новорожденных крысят. Архив патологии. 2015;77(6):39-44. https://doi.org/10.17116/patol201577639-44

Авторы:

Заднипряный И.В.

Медицинская академия им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия

Все авторы (3)

Гипоксия является ведущим фактором формирования необратимых поражений, приводящих к нарушению вегетативной регуляции коронарных сосудов, ухудшению энергетического обмена с резким уменьшением образования макроэргических соединений в митохондриях сократительных и проводящих кардиомиоцитов. Известно, что многочисленные нитросоединения, загрязняющие среду обитания, играют значимую роль в развитии внутриутробной гипоксии и гипотрофии плода, а также способны проникать в материнское молоко, что обусловливает необходимость всестороннего изучения характера их воздействия на организм новорожденного [1, 2].

Особый интерес представляет изучение широко распространенного в современной среде обитания человека гипоксанта нитрита натрия [3]. Токсическое действие этого соединения связано с метгемоглобинобразующим эффектом, развитием гистотоксической гипоксии, тяжесть которой определяется дозами нитрита натрия [4]. Установлено, что метгемоглобинемия в два раза сильнее подавляет дыхательную функцию крови по сравнению со снижением уровня кислорода в воздухе, поэтому превышение допустимых концентраций нитритов в естественных источниках поступления их в организм представляет определенную угрозу для потомства. Работы, выполненные ранее, свидетельствуют о том, что восстановление метаболических процессов в организме больных с гипоксическими состояниями может быть достигнуто путем применения лекарственных препаратов, содержащих сукцинат [5]. Отсутствие адекватного увеличения кислородного баланса организма не только становится препятствием на пути обеспечения полноценного эффекта от проводимой терапии, но и может привести к обратным последствиям. Поэтому предпосылкой для разработки эффективных антигипоксантов стало включение в их состав янтарной кислоты, имеющей свойства не только субстратного антигипоксанта, но что самое главное, свойствами сигнальной молекулы, запускающей важнейшие биохимические механизмы адаптации организма при воздействии экстремальных факторов среды [6].

В связи с этим, большой интерес представляет изучение эффективности отечественных препаратов реамберин и цитофлавин (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург). Реамберин относится к субстратам энергетического обмена. В состав препарата входят соль янтарной кислоты и микроэлементы (магний, калий, натрия хлорид), он оказывает антиоксидантное и антигипоксическое, энергопротекторное действие, уменьшает продукцию свободных радикалов, утилизирует жирные кислоты и глюкозу в клетках, нормализует кислотно-щелочной баланс и газовый состав крови.

Цитофлавин относится к комбинированным препаратам янтарной кислоты с нейропротекторным действием. Оказывает антигипоксическое и антиоксидантное действие. Еще одна особенность препарата связана с тем, что все компоненты, входящие в его состав, являются естественными метаболитами. Важной особенностью данной комбинации является наличие в ней N-метилглюкамина, выполняющего роль своеобразного транспортера янтарной кислоты в клетки [7].

Цель работы — изучение антиоксидантной активности, а также оценка эффективности кардиопротекторного воздействия препаратов реамберин и цитофлавин на кардиомиоциты новорожденных крысят в условиях хронической гемической гипоксии.

Материал и методы

Для экспериментального моделирования внутриутробной гипоксии был использован широко распространенный в современной среде обитания человека гипоксант нитрит натрия (NaNO2). Эксперимент выполнен на 23 трехдневных крысятах, рожденных 15-ю самками трехмесячных белых крыс линии Wistar, массой 3—6,5 г, разделенных на три опытные группы (табл. 1).

Таблица 1. Распределение животных по опытным группам

Беременность и подготовку к окоту проводили в соответствии с рекомендациями А.О. Ковалевского (1951). На протяжении всей беременности и в течение 3 дней после родов самкам всех опытных групп ежедневно внутрибрюшинно вводили нитрит натрия в дозе 5 мг/100 г массы (доза, вызывающая гипоксию средней тяжести).

Для получения значений нормы исследуемых показателей была сформирована группа контроля — 6 крысят, рожденных от интактных самок.

Животных выводили из эксперимента под наркозом из смеси эфира с хлороформом с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных [8].

После проведения торако- и перикардиотомии сердце вынимали и сразу же помещали в кардиоплегический раствор (0,9% КСl при температуре 0 °С), чем достигалась остановка сердца в диастолу. Разрез сердца проводился с учетом расположения магистральных путей проводящей системы. Подготовку материала для ультрамикроскопического исследования проводили по стандартной методике. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме УМТП-4 (Украина), окрашивали толуидиновым синим, контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом, просмотр осуществлялся на электронном микроскопе ПЭМ-125 Selmi (Украина).

Для проведения иммуногистохимических исследований использовали иммуногистостейнер DakoAutostainer («DakoCytomation», Дания), в качестве первичных использовались моноклональные антитела к каспазе-3 (Caspase-3, клон 3CSP03, «ThermoScientific») в разведении 1:200 соответственно. Исследования микропрепаратов проводили на микроскопе Olympus CX-31 (Япония).

Биохимические исследования сыворотки крови проводили у всех групп животных, подвергшихся эксперименту, и включали:

— определение уровня малонового диальдегида (МДА) как вторичного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) в реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (при помощи диагностических наборов ТБК-Агат). Оптическую плотность измеряли при 535 и 570 нм. Расчет ТБК-активных продуктов производили по формуле:

С = D535 – D570 ·16,

0,156

где С — оптическая плотность; D535 — длина волны 535 нм; D570 — длина волны, равная 570 нм. Содержание ТБК-активных продуктов выражали в мкмоль/л;

— определение карбонильных соединений, образующихся при модификации белков в состоянии окислительного стресса, вызванного воздействием нитрита натрия, с целью изучения процессов окислительной модификации белков (ОМБ). Изучение спонтанной ОМБ проводилось по методу Mihara и R. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [9]. Спектрофотометрирование проводили при длине волн 270, 274 и 363 нм. Результаты измерения представлены в единицах оптической плотности (усл. ед.). Изучение биохимических показателей проводили на спектрофотометре СФ-2000;

— определение уровня сукцинатдегидрогеназы (СДГ), фермента, в значительной мере определяющего скорость потребления кислорода и образования АТФ в дыхательной цепи, цитохимическим методом, количественным методом по Р.П. Нарциссову в модификации М.Н. Кондрашевой [10].

Статистическая обработка полученных данных проведена методом вариационной статистики с помощью программ Microsoft Excel 2007. Проверка статистических гипотез осуществлялась по t-критерию Стьюдента. При оценке статистических гипотез принимались следующие уровни значимости: p<0,05, p<0,01.

Результаты и обсуждение

Влияние гемической гипоксии на новорожденных крысят (1-я группа), согласно данным электронной микроскопии, проявляется выраженным повреждением клеточных мембран кардиомиоцитов, что приводит к тотальной и субтотальной деструкции митохондриальных крист и мембран митохондрий, сопровождающейся локальным лизисом миофибрилл и формированием ригорных комплексов. Повреждения плазмалеммы и митохондриальных мембран наблюдалось также в эндотелиоцитах кровеносных капилляров (см. рис. 1, а).

Рис. 1. Морфологические изменения миокарда крысят в условиях гемической гипоксии. а — лизис митохондриальных крист. Миокард крысят 1-й группы. ТЭМ. ×18 000; б — экспрессия каспазы в соседних кардиомиоцитах при введении нитрита натрия. Миокард крысят 1-й группы. Иммунопозитивное окрашивание Еnvision. ×400; в — появление большого числа гетерогенных митохондрий с плотноупакованными кристами. Миокард крысят 3-й (цитофлавин) группы. ТЭМ. ×12 000; г — экспрессия каспазы в единичных кардиомиоцитах после введения цитофлавина. Миокард крысят 3-й группы. Иммунопозитивное окрашивание Еnvision. ×400.

Вместе с тем у крысят 2-й (реамберин) и 3-й (цитофлавин) групп повреждения в кардиомиоцитах преимущественно носили обратимый характер. Эти изменения заключались в неравномерной конденсации хроматина, очаговом лизисе митохондриальных крист, при этом большинство митохондрий сохраняли свою нормальную структуру. Гипертрофированные кардиомиоциты отличались увеличением количества гетерогенных митохондрий, наличием гранул гликогена, более крупными размерами ядра, увеличением количества ядрышек, что является свидетельством компенсаторных процессов (см. рис. 1, в).

Одним из механизмов, позволяющих контролировать воспалительные реакции, является апоптоз нейтрофилов, который увеличивается за счет действия антиапоптозных факторов, образующихся в очаге воспаления. При этом одним из важных эффекторов апоптоза является каспаза-3, активация которой может быть следствием выявленного нарушения целостности митохондриальной мембраны.

Было выявлено, что в 1-й (основной) группе каспаза-3 экспрессировалась мозаично в некоторых эндотелиоцитах, а также в группах соседних кардиомиоцитов, в которых дополнительно определялась деградация ядра, что трактовалось как признак начальных апоптотических изменений (см. рис. 1, б).

У животных 2-й (реамберин) и 3-й (цитофлавин) групп экспрессия каспазы выявлялась лишь в единичных кардиомиоцитах. Кроме того, отмечалось уменьшение явлений интерстициального отека что свидетельствовало о выраженном мембранопротекторном и антиапоптотическом эффекте препаратов.

Исследование содержание малонового диальдегида (МДА), как вторичного продукта ПОЛ, выявило (табл. 2) повышение уровня в 1-й (опытной) группе с гемической гипоксией в 4,7 раза, во 2-й (реамберин) группе — в 3,8 раза, а в 3-й (цитофлавин) — в 3 раза по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,01).

Таблица 2. Показатели перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков сыворотки крови в контроле и в опыте Примечание. Значимость различий от контроля: * — рн<0,05; ** — рн< 0,01; *** — рн<0,001.

Повышение активности процессов перекисного окисления мембранных липидов обусловливает увеличение образования гидроксильных радикалов, что в свою очередь ведет к необратимым структурным изменениям клеточных и внутриклеточных мембран. Выявленный антиоксидантный эффект производных янтарной кислоты (в большей степени — цитофлавина, в меньшей — реамберина) проявлялся в достоверном подавлении этих процессов и, как следствие, меньшем повреждении клеток.

Анализ показателей ОМБ также выявил повышение в 1-й (основной) группе в 4,5 раза, во 2-й группе (реамберин) — в 3,2 раза и в 3-й группе (цитофлавин) — в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой (р<0,05).

Таким образом, полученные результаты подтверждают данные о том, что препараты, содержащие янтарную кислоту, (в большей степени — цитофлавин, в меньшей — реамберин) в условиях резкого уменьшения кислородной емкости крови снижают образование свободных радикалов, восстанавливают активность ферментов антиоксидантной защиты и энергетического потенциала клетки.

Цитохимическое определение активности СДГ по восстановлению тетразолиевых красителей (формазана) в лимфоцитах является показателем уровня метаболизма в организме, что было подтверждено данными, полученными в настоящем исследовании (см. рис. 2).

Рис. 2. Гранулы формазана в лимфоцитах периферической крови новорожденных крысят (отмечены стрелками). а — 1-я группа (основная), уровень СДГ 4,18±0,34 ед.; б — 3-я группа (цитофлавин), уровень СДГ 6,71±1,52 ед. ×1000.

Так, уровень активности СДГ в контрольной группе (норма) составил 8,93±0,27 ед., в то время как в 1-й (основной) группе (гемическая гипоксия) он был снижен в 2 раза (4,18±0,34 ед.), во 2-й (реамберин) группе — в 1,6 раза (5,69±1,06 ед.), а в 3-й (цитофлавин) группе — в 1,3 раза (6,71±1,52 ед.) соответственно (р<0,05). Снижение уровня СДГ указывает на угнетение окислительно-восстановительных процессов в цикле Кребса и снижение уровня энергетического обмена.

Таким образом, в ходе данного экспериментального исследования, помимо ультраструктурных изменений кардиомиоцитов и эндотелиоцитов различной степени выраженности, выявлены биохимические и цитохимические данные, подтверждающие развитие митохондриальной дисфункции, развивающейся под влиянием гемической гипоксии.

Наиболее выраженные повреждения, сопровождающиеся нарушением структуры и очаговым лизисом миофибрилл, отмечены в клеточных и митохондриальных мембранах, что может рассматриваться как морфологический субстрат аритмии.

Таким образом, для коррекции энергетического и обменного дисбаланса, развивающегося вследствие гипоксии, можно использовать субстратные антигипоксанты, содержащие сукцинат (реамберин, цитофлавин), так как экспериментально доказано, что компоненты этих препаратов (в большей степени — цитофлавин, в меньшей — реамберин) усиливают компенсаторную активацию аэробного гликолиза и активируют энергосинтезирующую функцию митохондрий, обеспечивают более экономное расходование кислорода и связанных с ним макроэргов, что обеспечивает защиту миокарда при гипоксии гемического генеза.

Заключение

Экспериментально выявлено, что внутриутробная хроническая гемическая гипоксия вызывает выраженное повреждение клеточных мембран кардиомиоцитов, плазмолеммы и митохондриальных мембран в эндотелиоцитах кровеносных капилляров; капсаза-3, один из важных эффекторов апоптоза, в условиях гипоксии экспрессировалась мозаично в некоторых эндотелиоцитах, а также в группах соседних кардиомиоцитов, в которых дополнительно определялась деградация ядра, что трактовалось как признак начальных апоптотических изменений.

При этом у новорожденных крысят, получивших реамберин и цитофлавин, эти изменения в клеточных мембранах носили обратимый характер, а экспрессия капсазы-3 выявлялась лишь в единичных кардиомиоцитах на фоне уменьшения явлений интерстициального отека, что подтверждало выраженный мембранопротекторный и антиапоптотический эффект этих препаратов.

Изучение биохимических показателей: содержание малонового диальдегида и показателей окислительной модификации белков при гипоксии выявило повышение этих показателей в 4,5 и 4,7 раза соответственно, в то время как изменения этих показателей было менее выражено в группах реамберина (в 3,8 и 3,2 раза соответственно) и цитофлавина (в 2,5 и 2,3 раза соответственно).

Определение активности сукцинатдегидрогеназы цитохимическим методом выявило достоверное снижение уровня фермента при гипоксии в 2 раза, под влиянием реамберина — в 1,6 раза, а цитофлавина — в 1,3 раза (р<0,05).

Таким образом, экспериментально обосновано, что применение реамберина и цитофлавина позволяет уменьшить проявления митохондриальной дисфункции и снизить степень повреждения кардиомиоцитов у новорожденных крысят за счет их антиоксидантных, антиапоптотических и мембранопротекторных свойств. Янтарная кислота в сочетании с другими компонентами препаратов достоверно подавляет перекисное окисление липидов, нормализует соотношение липид—белок, что улучшает структуру и функцию клеточных и митохондриальных мембран.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.В.З., Т.П.С.

Сбор и обработка материала: Т.П.С.

Статистическая обработка: Т.П.С.

Написание текста: И.В.З., О.С.Т., Т.П.С.

Редактирование: И.В.З., О.С.Т.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail