Шехтер А.Б.

Первый МГМУ им. И.М.Сеченова

Гуллер А.Е.

ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия; Университет Маккуори, Сидней, Австралия

Истранов Л.П.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия

Истранова Е.В.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия

Бутнару Д.В.

ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия

Винаров А.З.

Научно-исследовательский институт уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, Москва; ГБОУ ВПО "Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова", Москва

Захаркина О.Л.

Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Троицк

Курков А.В.

ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия

Кантимеров Д.Ф.

ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия

Антонов Е.Н.

ФГБУН «Институт проблем лазерных и информационных технологий» РАН, Москва, Россия

Марисов Л.В.

ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия

Глыбочко П.В.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, Москва, Россия

Морфология коллагеновых матриксов для тканевой инженерии (биосовместимость, биодеградация, тканевая реакция)

Журнал: Архив патологии. 2015;77(6): 29-38

Просмотров : 14

Загрузок :

Как цитировать

Шехтер А. Б., Гуллер А. Е., Истранов Л. П., Истранова Е. В., Бутнару Д. В., Винаров А. З., Захаркина О. Л., Курков А. В., Кантимеров Д. Ф., Антонов Е. Н., Марисов Л. В., Глыбочко П. В. Морфология коллагеновых матриксов для тканевой инженерии (биосовместимость, биодеградация, тканевая реакция). Архив патологии. 2015;77(6):29-38. https://doi.org/10.17116/patol201577629-38

Авторы:

Шехтер А.Б.

Первый МГМУ им. И.М.Сеченова

Все авторы (12)

Тканевая инженерия является одним из наиболее перспективных направлений регенеративной медицины. Ведется активная разработка тканеинженерных конструкций (ТИК), состоящих из подложек-носителей, называемых матриксами, матрицами или скаффолдами, и культивируемых на них клеток различных типов. ТИК используются, в основном, в качестве пластического материала для реконструктивной хирургии [1]. Так, в урологии ТИК применяются для хирургического лечения стриктур уретры, увеличения стенки мочевого пузыря и др. [2, 3]. Особое внимание уделяется структуре и составу матриксов, так как помимо адекватных механических свойств, делающих их пригодными для хирургического применения, они должны обеспечивать прикрепление и рост клеток, быть биосовместимыми (не иметь токсических, иммуногенных и аллергогенных свойств), обладать биорегулируемой резорбцией, не вызывать воспалительной и дистрофической тканевой реакции, замещаясь в конечном итоге собственными тканями организма. Кроме того, желательно, чтобы скаффолды обладали пористой структурой, обеспечивающей быстрое прорастание в него клеток и сосудов реципиента для питания и приживления ТИК.

В настоящее время предложено множество скаффолдов из различных биологических и синтетических материалов. Важное место среди них занимают коллагеновые материалы, в значительной степени отвечающие перечисленным выше требованиям. По способу получения коллагеновые скаффолды подразделяются на два типа: 1) децеллюляризированные коллагенсодержащие ткани и 2) биоматериалы, полученные из растворов коллагена. Децеллюляризация (ДЦЛ) представляет собой процедуру ферментной или физической обработки тканей, обеспечивающую разрушение клеточных элементов при сохранении внеклеточного матрикса [4, 5]. Другой подход основан на двух последовательных процессах: растворении коллагена, полученного из различных тканей, и последующей реконструкции коллагеновых фибрилл из раствора. Биоматериалы (губки, пленки, гидрогели) используются в виде скаффолдов для ТИК или пластического материала для хирургии [5]. Для решения проблемы недостаточной прочности матриксов могут быть использованы гибридные скаффолды, представляющие собой композиты коллагена и синтетических полимеров [6].

Несмотря на большое количество работ, посвященных созданию и применению разнообразных коллагеновых скаффолдов для ТИК, сравнительные морфологические исследования биосовместимости и биодеградации коллагенсодержащих скаффолдов различных типов, учитывающие выраженность тканевой реакции на их имплантацию in vivo и ее соотношение с изменениями структурной организации коллагенового материала, отсутствуют.

Цель настоящей работы — выбор оптимальных материалов для тканевой инженерии в урологии и других областях медицины на основании изучения динамики морфологических изменений 9 типов коллагеновых и гибридных скаффолдов при подкожной имплантации в эксперименте на крысах с использованием методов гистологии, гистохимии и нелинейной оптической микроскопии (НЛОМ). Шесть скаффолдов были разработаны впервые и приготовлены по оригинальной технологии.

Материал и методы

Для исследования были приготовлены 9 видов коллагенсодержащих скаффолдов (табл. 1): три вида получены на основе реконструированного коллагена, ДЦЛ обработанные ткани животных и человека.

Таблица 1. Распределение экспериментальных групп по видам имплантированных коллагенсодержащих скаффолдов

Имплантационный тест был выполнен на 225 белых крысах линии Wistar. Животных наркотизировали растворами золетила (6 мг/кг, Zoletil 100, Италия) и рометара (0,5 мл/кг, Rometar, «Spofa», Прага). Под кожу в межлопаточной области были имплантированы образцы исследуемых скаффолдов размером 1×1 см. Животные были разделены на 9 групп по 25 крыс в группе и выводились из опыта путем передозировки золетила на 5, 10, 30, 60 и 90-е сутки — по 5 животных на срок. Область имплантации иссекали, полученные ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (г-э), пикрофуксином по ван Гизону (В-Г) на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна и изучали с помощью микроскопа Olympus BX51, оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия). Микрофотографирование препаратов проводили с помощью программы Launch Cam-View.

Неокрашенные препараты для НЛОМ толщиной 22 мкм изучались на базе приборного комплекса, включающего в себя инвертированный микроскоп Leica DMIRBE, систему сканирующей конфокальной микроскопии Leica TCS SP2, лазеры для возбуждения одно- и двухфотонной флюоресценции (ДФФ) и генерации второй гармоники (ГВГ). ГВГ-микроскопия позволяет избирательно визуализировать структуры, состоящие из фибриллярного коллагена, а ДФФ-микроскопия — получать изображения ткани, характеризующие ее общий план строения. Также использовали наложения ДФФ- и ГВГ-сигналов. Размер получаемых изображений соответствовал 375×375 мкм, а разрешение — 1024×1024 пикселя.

Содержание и использование лабораторных животных соответствовало рекомендациям локального комитета по этике при Первом МГМУ им. И.М. Сеченова.

Результаты исследования

В 1-й и 2-й группах (имплантация коллагеновых губок) тканевая реакция на имплантацию и динамика биодеградации скаффолдов были сходными. На 5-е сутки поры (ячейки) губок частично заполнялись фибрином, нейтрофилами и макрофагами, коллаген подвергался макрофагальной резорбции и лизису коллагеназами (рис. 1, а, б). Вокруг губок отмечался отек ткани, слабая воспалительная реакция, а также пролиферация фибробластов, которые вместе с новообразованными сосудами прорастали в периферические области губок (см. рис. 1, в). На 10-е сутки коллагеновые имплантаты практически полностью исчезали и замещались созревающей соединительной тканью (см. рис. 1, г), которая к 30-м суткам фиброзировалась и резко уменьшалась в объеме, а к 60-м суткам подвергалась инволюции.

Рис. 1. Имплантация коллагеновой губки, реконструированной из раствора коллагена. а — губка до имплантации, окраска В-Г. ×400; б — губка через 5 сут после имплантации, заполнение ячеек клетками; в — врастание фибробластов и сосудов в периферические ячейки губки на 5-е сутки после имплантации; г — 10-е сутки после имплантации, лизис коллагена, замещение губки грануляционной тканью, отдельные гигантские клетки; б—г — г-э. ×400.

В 3-й группе (имплантация коллаген-викрилового композита) к 10-м суткам коллаген резорбировался, замещаясь грануляционной тканью, клетки и сосуды которой прорастали между порами викриловой сетки (рис. 2, а). Через 30 сут викриловые нити сближались между собой вследствие фиброзирования соединительной ткани, а составляющие их филаменты частично подвергались резорбции макрофагами и многочисленными гигантскими клетками инородных тел (см. рис. 2, б). Через 60 сут грануляционная ткань еще больше фиброзировалась, нити викрила частично резорбировались (см. рис. 2, в), а к 90-м суткам они уже отсутствовали (см. рис. 2, г).

Рис. 2. Коллаген-викриловый композит. а — 10 сут после имплантации, замещение коллагеновой губки грануляционной тканью и прорастание ее через поры викриловой сетки, окраска г-э. ×100; б — 30 сут после имплантации, прорастание соединительной ткани между филаментами викриловых нитей, начинающаяся резорбция последних; в — 60 сут после имплантации, фиброзирование грануляционной ткани, частичный лизис викриловых нитей, много гигантских клеток; г — 90 сут после имплантации, инволюция фиброзной ткани, пустые ячейки после лизиса викрила, лимфомакрофагальная инфильтрация; б—г — окраска г-э. ×400.

В 4-й группе опытов (ДЦЛ и лиофилизированная дерма коров) через 7 сут матрикс оставался пористым. Толстые стенки пор состояли из бесклеточного коллагена (рис. 3, а). Вокруг имплантатов формировалась капсула из грануляционной ткани (см. рис. 3, б), а в периферический слой имплантатов прорастали тяжи фибробластов и макрофагов. Заметная резорбция коллагена имплантатов макрофагами и гигантскими многоядерными клетками происходила только на 30-е сутки (см. рис. 3, в). Через 60 сут в подкожной жировой ткани оставались лишь небольшие фрагменты коллагеновой губки, а через 90 сут следы имплантатов не обнаруживались, ткань подвергалась инволюции.

Рис. 3. Имплантация лиофилизированной ДЦЛ дермы коровы. а — 7 сут после имплантации, коллагеновые структуры гомогенны; в ячейках имплантата — фибрин, нейтрофилы, макрофаги и фибробласты; б — 7 сут после имплантации, незрелая капсула вокруг имплантата; в — 30 сут после имплантации, слева и в центре — резорбция коллагена макрофагами и гигантскими клетками, справа — капсула, видны гигантские клетки; г, д — НЛОМ-изображения через 7 сут после имплантации, отчетливо видны сигналы ДФФ (г) и ГВГ (д), крупные фрагменты имплантата имеют фибриллярную структуру с сильным сигналом ГВГ; е — наложение ДФФ- и ГВГ-изображений; а—в — окраска г-э. ×400.

По данным НЛОМ, на 7-е сутки материал характеризовался сильным и контрастным ГВГ-сигналом (см. рис. 3, г, д, е). При этом на ГВГ-изображении визуализировались фибриллярные структуры коллагена. Показательно, что при изучении таких образцов с помощью сканирующей и особенно трансмиссионной электронной микроскопии также выявляется фибриллярность коллагена, которая не видна на световой микроскопии [7]. К 30—60-м суткам интенсивность и контрастность ГВГ-сигнала оставшегося коллагена имплантата снижались, что свидетельствует об изменениях на молекулярном и фибриллярном уровнях во время резорбции. Остатки имплантатов окружались соединительнотканной капсулой, которая к 60-м суткам существенно уплотнялась и фиброзировалась, что выражалось в усилении ГВГ-сигнала собственного коллагена.

У животных 5-й группы, которым имплантировали аналогичный материал из дермы лошадей, через 7 сут материал также сохранял пористую структуру, но был более плотным. Поры (ячейки) имели меньший размер (рис. 4, а). Резорбция коллагена происходила быстрее (см. рис. 4, б). Через 60 и 90 сут имплантаты уже не выявлялись. В отличие от 4-й группы НЛОМ не выявила в коллагене имплантата контрастного сигнала ГВГ при наличии сигнала ДФФ (см. рис. 4, в, г, д), что, по нашим предыдущим исследованиям [7], свидетельствует о нарушении фибриллярной структуры.

Рис. 4. Имплантация лиофилизированной ДЦЛ дермы лошади. а — 7 сут после имплантации, поры губки содержат нейтрофилы и макрофаги, окраска г-э. ×200; б — 30 сут после имплантации, резорбция коллагена имплантата макрофагами и гигантскими клетками, окраска г-э. ×400; в, г, д — НЛОМ-изображения, 7 сут после имплантации, материал имплантата фрагментируется, остается шумовой сигнал ГВГ (г), ДФФ-сигнал сохраняется (в); д — наложение ДФФ- и ГВГ-изображений.

В 6-й группе (имплантация аналогичного материала дермы рыб) матрикс состоял из коллагеновых волокон, имеющих зигзагообразную форму и ориентированных параллельно. При этом пористая структура не выявлялась (рис. 5, а). Важной особенностью являлось формирование вокруг имплантатов более толстой капсулы, фиброзирующейся уже к 7-м суткам (см. рис. 5, б). В капсуле и окружающих тканях отмечалась лимфомакрофагальная инфильтрация, что, возможно, связано с большей иммуногенностью децеллюляризированной дермы рыб. Через 30 сут обнаруживалась интенсивная резорбция имплантатов макрофагами и гигантскими клетками, а к 60-м и 90-м суткам они уже не обнаруживались. При НЛОМ-исследовании на 7-е сутки в имплантатах были видны коллагеновые волокна и пучки с отчетливым сигналом ГВГ (см. рис. 5, в, г). В период от 30 до 60 сут наблюдалась фрагментация и лизис материала с постепенным снижением интенсивности и контрастности сигнала ГВГ.

Рис. 5. Имплантация лиофилизированной ДЦЛ дермы рыб, 7 сут после имплантации. а — зигзагообразная структура волокон имплантата; окраска г-э. ×400; б — толстая созревающая капсула; окраска г-э. ×200; в — НЛОМ-изображение, ГВГ-сигнал участка материала с зигзагообразной упаковкой коллагеновых пучков; г — наложение ДФФ- и ГВГ-изображений этого участка.

В 7-й группе на 7-е сутки после имплантации децеллюляризированной твердой мозговой оболочки в ней полностью сохранялась структура коллагеновых волокон. Вокруг скаффолдов формировалась капсула из грануляционной ткани. Через 30 и 60 сут имплантаты почти не изменялись, сохраняя плотную коллагеновую структуру, вокруг которой выявлялась зрелая соединительнотканная капсула (рис. 6, а). Через 90 сут имплантаты местами фрагментировались, но почти не прорастали соединительной тканью. При НЛОМ-исследовании на 7-е сутки (см. рис. 6, б) и в дальнейшем до 90 сут материал давал сильный ГВГ-сигнал.

Рис. 6. Имплантация скаффолдов ДЦЛ обработанной твердой мозговой оболочки (а, б) на 60-е сутки после имплантации и SIS (в, г) на 7-е сутки после имплантации. а — имплантат плотный и волокнистый, капсула отделена от оболочки слоем макрофагов и гигантских клеток (стрелки), окраска г-э. ×200; б — НЛОМ-изображение, сильный и контрастный сигнал ГВГ; в — яркая фуксинофилия плотных пучков коллагеновых волокон SIS в грануляционной ткани, часть пучков расслоена на более тонкие элементы со слабой фуксинофилией. ×200; г — тонкие коллагеновые волокна — фуксинофильны, фибриллярно-гранулярная субстанция — пикринофильна. ×400; окраска В-Г.

В 8-й группе на месте скаффолдов SIS на 7-е сутки обнаруживалась фиброзирующаяся грануляционная ткань, в которой были видны многочисленные лентовидные фуксинофильные по ван Гизону фрагменты имплантированного материала (см. рис. 6, в). Гигантоклеточная реакция при резорбции коллагена SIS была относительно слабой, резорбция коллагена происходила за счет активности макрофагов и ферментативного лизиса. На 30-е сутки только у части животных оставались фрагменты лентовидных пучков SIS, а имплантат в основном замещался фиброзированной грануляционной тканью, в которой определялись участки с особым строением: короткие и тонкие коллагеновые волокна со слабой фуксинофилией по ван Гизону, а между ними пикринофильная фибриллярно-глобулярная субстанция (см. рис. 6, г). Это свидетельствует об активной биодеградации коллагена SIS вплоть до тончайших фибрилл. Только у отдельных животных оставались небольшие очаги вышеописанной глобулярно-фибриллярной субстанции.

В 9-й группе через 7 сут стенка бедренной артерии, обработанная ферментом террилитином, состояла из коллагенового каркаса, полностью лишенного клеток, с частичным эластолизом. Коллагеновые волокна местами подвергались разволокнению и истончению (рис. 7, а). Имплантаты вызывали слабую тканевую реакцию: только к 30-м суткам вокруг имплантатов формировалась капсула из незрелой грануляционной ткани. Внутрь бывшей tunica media фибробласты не прорастали, за исключением торцов имплантатов (см. рис. 7, б). Эти признаки отражают относительно медленную биодеградацию матрикса и задержку его замещения соединительной тканью реципиента. Через 60 сут клеточная резорбция и прорастание клетками имплантата значительно усиливались (см. рис. 7, в). Через 90 сут на месте имплантации оставались небольшие фрагменты имплантата, окруженные макрофагами и гигантскими клетками (см. рис. 7, г). Таким образом, тканевая реакция на сосудистый скаффолд была слабой, а его биодеградация замедленной.

Рис. 7. Имплантация ДЦЛ обработанной стенки бедренной артерии. а — 7 сут после имплантации, разрыхление коллагенового каркаса, полная ДЦЛ, выраженный эластолиз, комбинированная окраска пикрофуксином и фуксилином. ×200; б — 30 сут после имплантации, прорастание грануляционной ткани и макрофагальная резорбция коллагена; в — 60 сут после имплантации, резорбция имплантата, замещение сосудистой стенки грануляционной тканью (стрелками обозначены остатки трансплантата); г — 90 сут после имплантации, небольшие фрагменты трансплантата окружены макрофагами и гигантскими клетками; б, в — окраска г-э. ×200; г — окраска г-э. ×400.

Обсуждение

Сравнительное морфологическое изучение коллагеновых скаффолдов для ТИК в процессе их постимплантационной резорбции и замещения соединительной тканью имеет важнейшее значение для разработки оптимальных методов тканевой инженерии как в урологии, так и в других областях медицины. Коллагеновые матриксы, отвечая всем требованиям к скаффолдам для ТИК (см. введение), имеют значительные преимущества перед скаффолдами из других компонентов межклеточного матрикса (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, эластин), а также других биоматериалов (хитозан, фиброин и др.), не говоря уже о скаффолдах из синтетических полимеров [8]. Во-первых, одно из важнейших достоинств коллагеновых матриксов заключается в том, что продукты разрушения коллагена, благодаря специфическому взаимодействию в организме коллагена с фибробластами по механизму обратной связи, стимулируют пролиферацию фибробластов и биосинтез собственного коллагена, т. е. регенерацию соединительной ткани [9]. Во-вторых, коллагеновые матриксы являются оптимальными скаффолдами для адгезии и роста клеток in vitro и in vivo, особенно при условии наличия достаточно развитой системы пор для питания клеток. В-третьих, биодеградацию коллагена можно регулировать, влияя на межмолекулярные сшивки. В-четвертых, коллаген легко образует комплексы с различными биологически активными веществами, положительно влияющими на регенерацию [10, 11].

В нашем исследовании коллагеновая губка (в том числе прессованная), реконструированная из раствора коллагена дермы коровы, является биосовместимой и, обладая пористой структурой, быстро прорастает собственными клетками и сосудами. Однако первоначально она имеет сравнительно низкую механическую прочность, а после имплантации быстро (до 10 сут) резорбируется макрофагами, что делает ее неприемлемой для пластики трубчатых и полых органов (уретры, мочеточника, мочевого пузыря, сосудов, трахеи и т. д.), имеющих плотную стенку. В то же время эти материалы, по нашему опыту, перспективны для применения как скаффолды для ТИК и бесклеточные пластические материалы для замещения дефектов хряща и внутренних органов, тампонирования костных и других полостей, лечения кожных ран, трофических язв и ожогов [11]. Композит из уплотненной губки, полученной из реконструированного коллагена и викриловой сетки, обладает удовлетворительными свойствами для пластики трубчатых органов, так как совмещает хорошие механические свойства викрила и пористую структуру губки, ускоряющую прорастание клеток и сосудов для питания культивируемых эпителия, фибробластов и гладких мышц.

Децеллюляризированная дерма коров и лошадей в результате лиофилизации также приобретает пористую структуру, но более прочную, чем в губке из раствора коллагена, что подтверждается сохранностью фибрилл коллагена с периодической исчерченностью. Эти оригинальные матриксы имеют безусловную перспективу клинического и экспериментального применения, но нуждаются в дальнейшей модификации. Подслизистая основа кишки (SIS), уже сейчас используемая во многих исследованиях, имеет хорошие свойства, так как сравнительно быстро прорастает клетками и резорбируется. В настоящее время мы разработали материал на основе лиофилизированных матриц SIS, который показал улучшенные свойства по сравнению с исходным материалом. Ферментообработанные бесклеточные бедренные артерии, в которых остается только коллагеновый каркас, уже использовались нами в качестве ТИК для пластики уретры в эксперименте и клинике [12, 13].

Необходимо отметить, что настоящая работа является одним из фрагментов большого исследования коллектива авторов по созданию оптимальной ТИК для урологии и других областей медицины. Данные о технологии коллагеновых и гибридных матриксов, их структуре и ультраструктуре, механических свойствах, комплексообразовании с биологически активными веществами, особенностях культивирования на матриксах клеток, экспериментальных и клинических результатах пластики мочевых органов уже опубликованы [13, 14] и будут представлены в дальнейших наших публикациях.

Заключение

Сравнительное морфологическое изучение 9 видов коллагенсодержащих материалов позволило на основании результатов имплантационного теста (тканевой реакции, биосовместимости и биодеструкции) выбрать три наиболее адекватных для трубчатых ТИК матрикса (два из них изготовлены по оригинальным методикам) в качестве гибридных скаффолдов для ТИК: гибридный матрикс на основе уплотненной коллагеновой губки и викриловой сетки, децеллюляризированную и лиофилизированную дерму коров и подслизистую тонкой кишки свиньи (SIS). Эти и остальные изученные коллагеновые матриксы в различных формах могут использоваться в других сферах регенеративной медицины для ТИК или в виде бесклеточных материалов для направленной регенерации.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по грантам № 13−04−12075 офи_м и № 13−02−01363-а.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Б.Ш., А.З.В., Д.В.Б., П.В.Г.

Сбор и обработка материала: А.Б.Ш., А.Е.Г., О.Л.З., А.В.К., Д.Ф.К., Е.Н.А., Л.П.Я., С.В.И., Л.В.М.

Написание текста: А.Б.Ш.

Редактирование: А.Б.Ш., А.Е.Г.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail