Чумаченко П.В.

Лаборатория патоморфологии сердечно-сосудистых заболеваний

Иванова А.Г.

отделение патологоанатомическое I

Белоконь Е.В.

Акчурин Р.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии» Минздрава РФ, Москва, Россия

Молекулы адгезии и субпопуляции мононуклеарных клеток в коронарных и легочных артериях у больных ИБС

Журнал: Архив патологии. 2015;77(6): 9-14

Просмотров : 27

Загрузок :

Как цитировать

Чумаченко П. В., Иванова А. Г., Белоконь Е. В., Акчурин Р. С. Молекулы адгезии и субпопуляции мононуклеарных клеток в коронарных и легочных артериях у больных ИБС. Архив патологии. 2015;77(6):9-14. https://doi.org/10.17116/patol20157769-14

Авторы:

Чумаченко П.В.

Лаборатория патоморфологии сердечно-сосудистых заболеваний

Все авторы (4)

Эндотелиальные клетки играют ключевую роль в целом ряде физиологических процессов, таких как регулирование тонуса сосудов и кровотока в них, тромбообразование, участвуют в воспалении и ангиогенезе, а также активно влияют на такие патологические процессы, как артерииты, тромбофлебиты и атеросклероз. Атеросклероз — многофакторное заболевание, в котором дисфункция эндотелия и воспаление обусловливают прогрессирование друг друга. На ранних стадиях атеросклеротического процесса дисфункция эндотелия может развиваться в ответ на воздействие воспалительных хемокинов, вырабатываемых мононуклеарами крови (фактор некроза опухоли α, интерферон-γ, интерлейкин 1, 2 и др.) [1]. Дисфункция эндотелия сопровождается экспрессией на эндотелиальных клетках молекул адгезии, которые способствуют прилипанию мононуклеаров крови к эндотелиальным клеткам. Адгезированные мононуклеары крови секретируют хемокины, которые могут вызывать еще большую дисфункцию эндотелиальных клеток. Таким образом, создается порочный круг, приводящий к дисфункции эндотелия, а в дальнейшем и к его повреждению.

Процесс адгезии мононуклеаров крови к эндотелию сложен и состоит из нескольких стадий: 1) «быстрое качение»; 2) «медленное качение» (или стреноживание); 3) адгезия; 4) миграция — проникновение мононуклеаров крови в субэндотелиальное пространство [2, 3]. Насколько сложен процесс прилипания (адгезии) мононуклеаров крови к эндотелиальным клеткам, указывает даже простое перечисление участвующих в этом процессе рецепторов (интегринов) мононуклеарных клеток (LFA-1, VLA-4, рецептор к фибронектину, рецептор к ламинину, MAC-1, L-селектин, CD31 и др.) [2]. Не менее обширен и перечень участвующих в процессе прилипания и экспрессируемых эндотелием молекул адгезии (Р-селектин, Е-селектин, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD44L, JAM-B, JAM-C, CD31).

Отдельные стороны сложного процесса взаимодействия мононуклеаров крови и эндотелия изучены в эксперименте на животных. В экспериментах in vivo показано, что дисфункция эндотелия приводит к экспрессии этими клетками Р- и Е-селектинов, заставляющих находящиеся в центре потока крови мононуклеары двигаться в сторону сосудистой стенки и катиться (перекатываться) по эндотелию (стадии «быстрого и медленного качения»). Если неблагоприятные факторы продолжают действовать на эндотелий, происходит экспрессия эндотелиальными клетками молекул адгезии ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD31 и др. и наступает стадия прилипания мононуклеаров крови к эндотелию (стадия адгезии мононуклеаров крови к эндотелиальным клеткам).

Стадия субэндотелиального проникновения мононуклеаров крови в интиму связана с молекулами адгезии JAM-B, JAM-C, CD199, CD31 и др. (стадия миграции мононуклеаров крови в интиму сосудов) [2, 3].

Взаимодействие (адгезия) моноцитов и других мононуклеаров крови с эндотелием играет важную роль на ранних стадиях атеросклеротического процесса и при прогрессировании этого заболевания. Основное внимание в этой работе уделили изучению 3-й и 4-й стадии этого процесса (адгезия и проникновение мононуклеаров в субэндотелиальное пространство), исследованию экспрессии эндотелием молекул адгезии. Ключевую роль в адгезии к эндотелию (3-я стадия) и миграции мононуклеаров в субэндотелиальное пространство (4-я стадия) играет Platelet-endothelial cell adhesion molecule PECAM (или по-другому CD31, или PECAM-1) [4, 5].

CD31 — это трансмембранный гликопротеин I типа (мол. масса 130 кД), экспрессирующийся на эндотелиальных клетках, в основном на их боковых поверхностях (на границах клеток), поскольку участвует в соединении между собой клеток эндотелия.

Цель настоящего исследования — изучение экспрессии молекул адгезии эндотелиальными клетками на разных стадиях атеросклеротического процесса.

Материал и методы

Материалом для исследования служили сегменты коронарных артерий (состоящие из интимы и примыкающей к ней медии), полученные во время коронарного шунтирования, сопровождающегося эндартерэктомией из коронарных артерий. Исследованию подверглись сегменты артерий, взятые у 37 мужчин (больные ИБС). Кроме этого, коронарные артерии и легочные артерии брали во время патологоанатомического исследования (10 мужчин), умерших от ИБС, если вскрытие проводилось не позднее 6 ч с момента смерти. Возраст больных ИБС колебался от 54 до 76 лет, умерших — от 55 до 87 лет. Исследовали участки с макроскопически не измененной интимой, липидными пятнами, атеромами и фиброатеромами. Атеросклеротические бляшки с явлениями кальциноза, изъязвлениями и тромбами не исследовали (см. таблицу).

Количество препаратов en face, полученных из коронарных артерий с различными атеросклеротическими изменениями Примечание. У одного больного ИБС или у одного умершего от ИБС в коронарных артериях встречались разные атеросклеротические изменения коронарных артерий (атерома и фиброатерома, и др.).

Взятый материал немедленно фиксировали в 4% параформе (рН 7,2—7,4) не менее 20 мин, промывали в фосфатном буфере (рН 7,2—7,4), после чего готовили препараты артерий en face по ранее описанной методике [6]. Полученные препараты инкубировали с моноклональными антителами к моноцитам и макрофагам (CD68, фирма «DAKO», Дания), Т-лимфоцитам (CD3, CD4, фирма «Beckman Coulter», Франция; CD8, «Сорбент», Россия), с антителами к ICAM-1, фактору Виллебранда и РЕСАМ (антитела получены от А.В. Мазурова, РКНПК Минздрава РФ) [7]. Реакцию визуализировали с помощью иммунопероксидазной реакции или метки щелочной фосфатазой. Иммуногистохимическую реакцию проводили в иммуностейнере Ventana (фирма «Roche», США). Отдельные иммуногистохимические реакции проводили без иммуностейнера по общепринятой методике.

После иммуногистохимической реакции препараты окрашивали гематоксилином, метиловым зеленым или на жир красителем Oil red.

Результаты и обсуждение

В окрашенных гематоксилином и Oil red срезах коронарных артерий, из которых сделаны препараты en face, обнаружили интактные участки, артерии с липидными пятнами, атеромами и фиброатеромами. Интактные по отношению к атеросклерозу участки встречались в основном в образцах из легочной артерии (см. рисунок, а).

Иммуногистохимическая реакция с антигенами мононуклеаров крови и антигенами эндотелиальных клеток у больных ИБС. а — препарат en face легочной артерии. Окраска гематоксилином и эозином. ×200; б — эндотелий коронарной артерии коричневого цвета. Иммунопероксидазная реакция с антителами к фактору Виллебранда. Ядра клеток окрашены гематоксилином. ×200; в — атерома в коронарной артерии сердца. CD3-Т-клетки черные (иммунопероксидазная реакция с визуализацией раствором ДАБ/Ni), а CD68 макрофаги красные (иммуногистохимическая реакция с меткой щелочной фосфатазой, визуализация раствором прочный красный/нафтол). Ядра клеток докрашены метиловым зеленым. ×200; г — иммунопероксидазная реакция с антителами к CD31-антигену. Препарат en face легочной артерии. Ядра клеток докрашены гематоксилином. ×400; д — иммунопероксидазная реакция с антителами к CD31-антигену. Препарат en face коронарной артерии сердца, просвет артерии широкий, атеросклеротические изменения (макроскопически) отсутствуют. ×200; е — препарат en face легочной артерии. Иммунопероксидазная реакция с антителами к CD4-Т-клеткам (черные) и иммуногистохимическая реакция с меченными щелочной фосфатазой антителами к CD8-Т-клеткам (красные). ×200; ж — микроэрозия в эндотелии легочной артерии. Иммунопероксидазная реакция с антителами к CD31-антигену. Препарат en face. ×400; з — множество микроэрозий в эндотелии сосуда. Препарат en face коронарной артерии с атеромой. Иммунопероксидазная реакция с антителами к CD31-антигену. ×200; и — эндотелий легочной артерии. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD31-антигену (красный), меченными щелочной фосфатазой, и иммунопероксидазная реакция с антителами к CD68-антигену, адгезированные моноциты черные. ×400.

В участках без атеросклеротических изменений эндотелий, выстилающий легочную артерию, имел полигональную форму, размеры клеток колебались в широких пределах. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD31-антигену обнаружила этот антиген на поверхности мембраны клеток, в области их контакта с окружающими эндотелиальными клетками (см. рисунок, г). В препаратах en face из субсегментарных ветвей легочной артерии выражена неоднородность выстилающего эти сосуды эндотелия. Наряду с вытянутыми вдоль продольной оси сосуда эндотелиальными клетками встречались места с полигональными клетками.

Адгезированные Т-клетки не встречались или выявлялись редко, как единичные. Клетки, содержащие CD68-антиген, отсутствовали. Антитела к фактору Виллебранда окрашивали клетки эндотелия.

В макроскопически нормальных коронарных артериях (без видимых атеросклеротических поражений) CD31-антиген локализовался по границам клеток, в области их контакта с другими эндотелиальными клетками (см. рисунок, д). Эндотелиальные клетки в коронарных артериях имели вытянутую форму, ориентированы продольно по направлению тока крови в сосуде, размеры клеток не сильно отличались друг от друга.

В макроскопически интактной интиме на поверхности эндотелия адгезированные моноциты (CD68-клетки) выявлялись редко и в виде единичных клеток. Субэндотелиально расположенные макрофаги в этих участках отсутствовали. При этом в свободных от липидов участках часто можно обнаружить группы адгезированных Т-клеток (как CD4, так и CD8). Встречались участки, где отдельные небольшие группы клеток располагались субэндотелиально. Антитела к фактору Виллебранда реагировали с тельцами Вейбеля—Паладе в эндотелиальных клетках, интенсивно окрашивая пласт эндотелиальных клеток (см. рисунок, б).

В препаратах en face легочной артерии с липидными пятнами и липидными полосками эндотелиальные клетки имели полигональную форму, их размеры колебались в широких пределах. Проведенная иммуногистохимическая реакция выявила CD31-антиген не только на границах эндотелиальных клеток, но и на поверхности мембраны, обращенной в просвет сосуда. Судя по интенсивности окраски иммуногистохимических препаратов, концентрация этого антигена на одних клетках была выше, на других — ниже. Часто это были соседние клетки. На поверхности эндотелия и субэндотелиально встречались единичные клетки и небольшие кластеры CD4 и CD8 Т-клеток. Единичные клетки и небольшие кластеры CD68-клеток были адгезированы на эндотелии и обнаруживались в интиме артерий (см. рисунок, и). Кластеры CD68-клеток четко соответствовали липидным пятнам в сосуде. Группы адгезированных на эндотелии Т-клеток были как в зоне отложений липидов, так и в интактных участках. Соотношение CD4 и CD8 Т-клеток, адгезированных на эндотелии и находящихся субэндотелиально, было примерно одинаковым (см. рисунок, е). Иммуногистохимическая реакция с антителами к фактору Виллебранда выявляла этот антиген в эндотелиальных клетках. На поверхности эндотелиальных клеток обнаруживали молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1. Эти антигены гомогенно распределялись по всей поверхности эндотелиальной клетки.

Эндотелий в коронарных артериях над липидными пятнами и липидными полосками имел как вытянутую форму, ориентированную продольно вдоль тока крови в сосуде, так и полигональную.

CD31-антиген локализовался главным образом вдоль границ эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки образовывали сплошной пласт. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD31 выявила у единичных эндотелиальных клеток неоднородность окраски границ. На границах отдельных клеток (местами и очень локально) CD31 отсутствовал, т. е. граница клетки в каком-то месте выглядела как бы разорванной, оставаясь анатомически целой. При иммуногистохимическом исследовании эндотелиальных клеток с помощью антител к CD31-антигену, помимо отдельных пограничных участков цитоплазматической мембраны, лишенных этого белка, обнаружили так называемые микроэрозии («бреши») в эндотелиальном покрове: места, где отсутствовала одна или несколько эндотелиальных клеток (см. рисунок, ж).

В интиме коронарных артерий с липидными пятнами выявлены большие скопления макрофагов с каплями липидов в цитоплазме. Встречались капли липидов, свободно лежащие в субэндотелиальном пространстве. Иммуногистохимически в этих местах обнаружены скопления адгезированных Т-клеток (CD4 Т-клеток и CD8 Т-клеток) и кластеры адгезированных моноцитов (CD68-клеток). Субэндотелиально в этих местах локализовались группы макрофагов (CD68-клеток) и Т-клеток (CD4, CD8). Соотношение CD4- и CD8-Т-клеток, адгезированных на эндотелии и находящихся субэндотелиально, было примерно одинаковым.

Клетки эндотелия интенсивно окрашивались при иммуногистохимической реакции с антителами к фактору Виллебранда. Следует отметить неоднородность окраски: пласт эндотелия содержал клетки, отличающиеся по интенсивности окраски. На поверхности эндотелиальных клеток обнаружены молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1.

Среди исследованных нами образцов легочных артерий атеромы и фиброатеромы отсутствовали.

В препаратах en face коронарных артерий с атеромами и фиброатеромами обнаружены как единичные клетки, так и кластеры адгезированных Т-клеток (CD4; СD8) и моноцитов (CD68) (см. рисунок, в, е). Большие группы этих клеток можно было видеть субэндотелиально. Цитоплазма макрофагов часто перегружена липидами. Липиды в виде капель встречались в интиме и вне клеток. Соотношение CD4- и CD8-Т-клеток было примерно одинаковым.

Макроскопически атеросклеротические бляшки были без эрозий и изъязвлений, но у 19 больных при реакции с антителами к CD31-антигену и фактору Виллебранда обнаружены повреждения эндотелия (микроэрозии) (см. рисунок, з). Дефекты в эндотелиальном покрове артерии по площади были равны одной или нескольким клеткам. Чаще такие дефекты (в препаратах en face) встречались непосредственно над атеромами и фиброатеромами. В области дна таких дефектов эндотелия были адгезированные мононуклеары крови и тромбоциты. Тромбоциты в дне «брешей» давали интенсивную иммунопероксидазную реакцию с антителами к CD31.

При иммуногистохимической реакции к CD31-антигену выявлено почти гомогенное его распределение по эндотелиальной клетке. Кроме продольно ориентированных по току крови эндотелиальных клеток, встречались кластеры полигональных клеток. Локализовались полигональные эндотелиальные клетки главным образом над атеросклеротическими бляшками.

Атеросклеротический процесс в легочной артерии развивается только в исключительных случаях (в основном при повышении давления в легочной артерии). Поэтому если макроскопически она не изменена и давление в легочной артерии не повышено, легочную артерию можно рассматривать как нормальную (как сосуд, в котором нет атеросклеротических изменений). Возможно поэтому адгезированные Т-клетки в легочной артерии у умерших без легочной гипертензии (без липидных пятен) не обнаружены. Можно утверждать, что макроскопически выглядевший интактным эндотелий коронарных артерий, очевидно, не является таковым, так как эти сосуды наиболее подвержены заболеванию и какие-то начальные изменения могут в них уже развиться, несмотря на отсутствие (видимых макроскопически) отложений липидов в интиме. Возможно этим и объясняется обнаруженные нами кластеры адгезированных Т-клеток на, казалось бы, нормальном эндотелии коронарных артерий. При прогрессировании атеросклеротического процесса количество этих клеток увеличивалось. Таким образом, можно предположить, что на самых ранних стадиях атеросклеротического процесса Т-клетки первыми реагируют на эту патологию и первыми внедряются в интиму артерий, еще до появления макрофагов и отложения в интиме липидов.

В атеросклеротических бляшках присутствуют CD4- и CD8-Т-клетки. Одни исследователи склоняются к тому, что в атеросклеротических бляшках доминируют CD4- Т-клетки [8], другие считают, что количество их примерно одинаково или даже CD8-Т-клеток больше [9, 10]. В нашем исследовании соотношение CD4- и CD8-Т-клеток среди адгезированных к эндотелию клеток было примерно равным. Однако этот вопрос нуждается в дальнейшем уточнении. Присутствие Т-клеток на всех стадиях атеросклеротического процесса доказывает их участие в патогенезе данного заболевания. Есть данные, что CD8-Т-клетки препятствуют развитию гиперплазии интимы и прогрессированию атеросклероза [11, 12]. Обнаружено, что Th reg (субпопуляция CD4-Т-клеток) при пересадке мышам с атеросклерозом ослабляет и замедляет его течение, другая субпопуляция Тh effect ускоряет течение атеросклеротического процесса [13, 14], т. е. теоретически появляется возможность воздействовать (с помощью пересадки субпопуляций Т-клеток больному) на атеросклеротический процесс.

Макрофаги и адгезированные на эндотелии моноциты (CD68 клетки) обнаружены уже на стадии липидных пятен, количество их возрастало параллельно прогрессированию атеросклеротического процесса. Все вышеперечисленное свидетельствует о непосредственном участии этих клеток на всех стадиях атеросклеротического процесса, начиная со стадии липидных пятен и заканчивая (в нашем случае) стадией атеромы и фиброатеромы. Следует отметить, что популяция CD68 клеток неоднородна. Выделяют М1-макрофаги провоспалительные, М2-макрофаги (M2a, M2b, M2c), ослабляющие течение воспаления и гемоглобин-ассоциированные макрофаги M (Hb) [15, 16]. Можно надеяться, что использование в работе методов, позволяющих детально дифференцировать эту популяцию клеток, будет способствовать получению новых интересных данных, которые прольют свет на течение атеросклеротического процесса у человека.

Молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1 обычно не подчеркивали границы эндотелиальных клеток (как было с антителами к CD31 (PECAM-1), а экспрессировались над всей поверхностью базальной мембраны эндотелиальной клетки. Клетки, содержащие эти молекулы адгезии, появлялись на стадии липидных пятен и липидных полос. С прогрессированием атеросклеротического процесса количество таких клеток увеличивалось, а интенсивность реакции возрастала.

Результаты работы подтвердили отмеченную ранее другими исследователями гетерогенность эндотелия [7, 17]. В крупных ветвях легочной артерии, где был липоидоз, обнаружена мозаичность экспрессии CD31-антигена. Одни эндотелиальные клетки были с высокой экспрессией этого антигена, а другие клетки не экспрессировали его или экспрессировали в крайне низкой концентрации. Проявлением гетерогенности является неоднородность экспрессии CD31 в пределах одной эндотелиальной клетки: встречаются эндотелиальные клетки, у которых CD31-антиген мембраны на протяжении какого-нибудь сегмента локально отсутствует. При этом клетка демонстрирует анатомическую целостность. Такие клетки мы встречали главным образом в артериях с липидными пятнами, атеромами и фиброатеромами. В сосудах без признаков атеросклеротического процесса их обнаружить не удалось.

При стенозе коронарных артерий атероматозными бляшками и фиброатеромами отдельные эндотелиальные клетки теряли CD31-антиген на всем протяжении боковой поверхности эндотелиальной клетки. Экспрессия этого антигена на поверхности мембраны клетки, обращенной в просвет сосуда, увеличивалась (визуально). Это привело к однородному окрашиванию пласта клеток, выстилающего коронарную артерию. Сравнительное патологоанатомическое исследование легочных артерий у этих умерших обнаружило полигональную форму эндотелия с четкой экспрессией CD31-антигена на боковой поверхности клетки. Мы считаем, что однородная экспрессия CD31-антигена свидетельствует о прогрессировании дисфункции эндотелия, развивающейся у больных с атеромами и фиброатеромами. Можно предполагать, что при дальнейшем прогрессировании дистрофического процесса клетка погибнет и на ее месте в эндотелии образуется дефект.

В нашем исследовании эндотелиальный покров над атеромами и фиброатеромами образовывал дефекты (места, где отсутствовали эндотелиальные клетки), по площади равные площади одной и более клеткам. На обычных (поперечных) гистологических срезах обнаружить такой дефект практически невозможно. Сочетание иммуногистохимической реакции с антителами к CD31-антигену или фактору Виллебранда с препаратами en face позволяет обнаружить такие дефекты в эндотелиальном покрове. В дне таких образований были адгезированные мононуклеары и тромбоциты, тромбоциты образовывали агрегаты. Такие изменения эндотелия над макроскопически стабильными бляшками с интактной покрышкой могут свидетельствовать о начале образования тромба на атеросклеротической бляшке. Подобные изменения эндотелия в коронарных артериях и аорте отмечали ранее и другие исследователи [18].

Таким образом, при микроскопическом исследовании препаратов en face на поверхности стабильных атеросклеротических бляшек иногда обнаруживаются микроочаговые дефекты в эндотелиальном покрове с тромбоцитарными агрегатами, свидетельствующие о начале формирования тромба. Можно предположить, что в данном случае мы имеем дело с самыми начальными изменениями, приводящими к развитию нестабильной атеросклеротической бляшки.

Похожие изменения наблюдали в культуре эндотелия. Уже через 3 ч после облучения в монослое культуры эндотелия появляются «бреши», т. е. среди плотно прижатых друг к другу клеток, образующих монослой, возникают округлые дефекты («бреши»), равные по площади одной клетке. При использовании вместе с облучением охлаждения эндотелия (выдерживания культуры эндотелия 15 мин при –15 °С) количество таких дефектов увеличивается [18].

Эксперименты P. Sharma и соавт. [17] с микросферами подтвердили, что такие изменения эндотелия происходят и in vivo.

Мы так подробно цитируем статью P. Sharma и соавт., поскольку считаем, что эндотелий стереотипно реагирует на разные негативные воздействия (как на облучение и температуру в культуре эндотелиальных клеток, так и на те патологические факторы, которые возникают в живом организме и приводят к атеросклерозу).

Заключение

Обнаружена гетерогенность эндотелиальных клеток в зависимости от их места нахождения и состояния. Эндотелиальные клетки в интактных к атеросклерозу коронарных артериях имеют вытянутую форму и ориентацию вдоль тока крови. Эти же эндотелиальные клетки над атеромами и фиброатеромами вытянутую форму меняют на полигональную.

Эндотелиальный покров макроскопически стабильных атеросклеротических бляшек обнаружил наличие микроэрозий (или микроочаговых дефектов) в эндотелии, на дне которых находились адгезированные мононуклеары крови и тромбоциты.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: П.В.Ч.

Сбор и обработка материала: А.Г.И., Е.В.Б.

Статистическая обработка: П.В.Ч.

Написание текста: П.В.Ч.

Редактирование: Р.С.А., П.В.Ч.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail