Пруткина Е.В.

ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава РФ

Сепп А.В.

ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава РФ

Цыбиков Н.Н.

ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, Чита, Россия, 672090

Экспрессия матриксной металлпротеиназы-2 и тканевого ингибитора 2-го типа в легких в зависимости от стадии развития экспериментального респираторного дистресс-синдрома

Журнал: Архив патологии. 2012;74(6): 23-27

Просмотров : 14

Загрузок :

Как цитировать

Пруткина Е. В., Сепп А. В., Цыбиков Н. Н. Экспрессия матриксной металлпротеиназы-2 и тканевого ингибитора 2-го типа в легких в зависимости от стадии развития экспериментального респираторного дистресс-синдрома. Архив патологии. 2012;74(6):23-27.

Авторы:

Пруткина Е.В.

ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава РФ

Все авторы (3)

Несмотря на активное изучение, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) остается одной из основных проблем современной реаниматологии. С 1990-х годов выделяют его раннюю стадию — острое повреждение легких (ОПЛ). В связи с большим количеством и гетерогенностью причин механизмы перехода обратимого ОПЛ в последующие фазы процесса исследованы недостаточно [1, 2], что делает фундаментальные изыскания в этом направлении особенно актуальными.

Основным звеном патогенеза ОПЛ/ОРДС является повреждение альвеолярно-капиллярной мембраны с развитием некардиогенного отека легких. Принимая во внимание, что в состав аэрогематического барьера входит общая базальная мембрана эпителия альвеол и эндотелия капилляров, возникло предположение об участии матриксных металлопротеиназ (ММР) в патогенезе синдрома. ММР — семейство протеолитических ферментов, расщепляющих основные компоненты внеклеточного матрикса. Они играют важную роль как в физиологических процессах (рост плаценты, эмбриогенез, репарация тканей), так и при патологии (опухолевая инвазия, фиброз легких, атеросклероз и др.) [3—5]. Одним из механизмов динамического сдерживания избыточной активности металлопротеиназ является синтез специфических тканевых ингибиторов — TIMP 1—4 [5—7].

Роль ММР в развитии ОПЛ/ОРДС изучали путем определения концентрации ферментов в крови и/или бронхоальвеолярной лаважной жидкости [1], что не всегда отражает истинную картину локального процесса.

В связи с этим целью настоящей работы стало исследование экспрессии ММР-2 и ее ингибитора TIMP-2 разными клетками в легких в зависимости от стадии развития экспериментального ОПЛ/ОРДС.

Материал и методы

ОПЛ/ОРДС воспроизводили по оригинальной методике на половозрелых нелинейных крысах-самцах. Под местной анестезией 0,25% раствором новокаина проводили тонкоигольную пункцию трахеи с одновременным однократным введением лизата 45—55 тыс. крысиных нейтрофилов в 0,15—0,20 мл 0,9% раствора NaCl [8]. В контрольной группе в эквивалентном объеме инъецировали стерильный 0,9% раствор NaCl. Животных выводили из эксперимента путем передозировки кетамина на 1-е (по 25 крыс в опыте и контроле), 3-и (по 24 особи) и 6-е (по 21 животному) сутки. Развитие ОПЛ/ОРДС во всех случаях подтверждали морфологически.

Отобранный аутопсийный материал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина (рН 7,1—7,2) в течение 12 ч, после чего фрагменты заливали в парафин. Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах легочной паренхимы биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом. Срезы толщиной 3—4 мкм депарафинизировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили двукратную обработку срезов в микроволновом режиме (мощность 650 Вт) в течение 15 мин с интервалом 5 мин между процедурами для охлаждения в цитратном буфере с pH 6,0 («Dako», Дания). В качестве первичных использовали видоспецифичные мышиные антитела к ММР-2 (8B4) и TIMP-2 (3А4) («Santa Cruz biotechnology», США) в рабочих разведениях 1:250 и 1:200 соответственно, инкубацию с которыми проводили при 36 °С в течение 30 мин. В качестве вторичных применяли биотинилированные антимышиные антитела в составе рекомендованной производителем системы визуализации ABS Staining System («Santa Cruz biotechnology», США), использующей в качестве хромогена 3,3-диаминобензидина тетрахлорид. Срезы, в частности клеточные ядра, дополнительно докрашивали водным раствором гематоксилина Гаррисона. Использовали рекомендованные производителем контрольные срезы: без первичных антител для исключения неспецифического окрашивания, в качестве положительного контроля — фрагменты тканей плаценты.

Величину экспрессии ферментов в срезе определяли для всех продуцирующих клеток раздельно: при 400-кратном увеличении подсчитывали не менее 100 целевых клеточных элементов в 10 случайно выбранных полях зрения. В каждом поле количественную оценку экспрессии антигена проводили в баллах по следующей шкале: отрицательный уровень — позитивных клеток менее 10% в поле зрения; 1 балл — наличие 10—25% клеток; 2 балла — 25—50% клеток; 3 балла — 50—75% клеток; 4 балла — окрашивание более 75% клеток [9].

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Biostat 3.03. При сравнении групп использовали критерий χ2. Различия считали значимыми при р≤0,05. Результаты представлены в виде процента полей зрения с соответствующим уровнем экспрессии антигена к исследованному числу полей в срезе.

Результаты и обсуждение

Как при развитии экспериментального ОПЛ/ОРДС, так и в контрольной группе MMP-2 в разной степени экспрессировали нейтрофилы, макрофаги, фибробласты, эндотелиоциты, альвеолоциты 1-го и 2-го типов.

В опытной группе через 24 ч определялась острая (экссудативная) стадия развития синдрома — морфологический эквивалент непосредственно ОПЛ [1, 10], которая характеризовалась проявлениями «острого неинфекционного диффузного альвеолита», с накоплением в просвете альвеол нейтрофилов, мононуклеарных клеток, десквамированных эпителиоцитов, отечной жидкости, эритроцитов. В просвете сосудов отмечались множественные агрегаты нейтрофилов (рис. 1).

Рисунок 1. Микрофото легочной паренхимы. Острая (экссудативная) стадия острого респираторного дистресс-синдрома. В просвете альвеол отечная жидкость, воспалительный клеточный инфильтрат представлен преимущественно мононуклеарными клетками с примесью нейтрофилов, десквамированных альвеолоцитов. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к MMP-2, хромоген — продукты реакции с диаминобензидином, фоновое докрашивание гематоксилином Гаррисона. ×400.
На этом фоне наибольшая экспрессия ММР-2 была выявлена в фибробластах, макрофагах, эндотелии и нейтрофилах; наименьшая — в альвеолоцитах 1-го типа (табл. 1).

У особей контрольной группы, независимо от временных промежутков эксперимента, при морфологическом исследовании в единичных случаях отмечались девиации, преимущественно в виде острых нарушений микроциркуляторного кровотока (полнокровие, агрегаты форменных элементов крови), частота встречаемости которых не имела статистической значимости. Зафиксированные спорадические отклонения в контроле мы связываем с особенностями танатогенеза подопытных животных. Через 24 ч после введения 0,9% раствора NaCl наибольшая экспрессия ММР-2 зафиксирована в эндотелии — 1—2 балла в 52% полей зрения, что было значительно меньше количества фермента в эндотелиоцитах на 1-е сутки развития экспериментального ОПЛ/ОРДС (р=0,000). Фибробласты, макрофаги, нейтрофилы и альвеолоциты 2-го типа экспрессировали металлопротеиназу в одинаковой степени (1—2 балла в 18—24%), но значительно меньше, чем в 1-е сутки ОПЛ/ОРДС (при всех сопоставлениях р=0,000). Исключение составили альвеолоциты 1-го типа: уровень экспрессии ими ММР-2 был одинаковым и в опыте, и в контроле (р=0,48).

На 3-и сутки эксперимента в легких животных опытной группы отмечались разрешение от отека, формирование множественных мелкоочаговых ателектазов, миграция мононуклеарных лейкоцитов, признаки пролиферации фибробластов и синтеза коллагена (рис. 2),

Рисунок 2. Микрофото легочной паренхимы. Начало пролиферативной фазы острого респираторного дистресс-синдрома. Разрешение от отека, формирование множественных мелкоочаговых ателектазов, миграция мононуклеарных клеток и пролиферации фибробластов. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к TIMP-2, хромоген — продукты реакции с диаминобензидином, фоновое докрашивание гематоксилином Гаррисона. ×400.
что является характерным для пролиферативной фазы ОРДС [1, 10]. В этой стадии экспрессия ММР-2 была самой высокой в фибробластах, но по сравнению с I фазой синдрома она снизилась (р=0,04). Лейкоциты, макрофаги, эндотелий и альвеолоциты 2-го типа экспрессировали энзим одинаковой степени (табл.2).
При сопоставлении экспрессии фермента этими клетками с уровнем предыдущей фазы ОПЛ/ОРДС, оказалось, что в нейтрофилах и альвеолоцитах 2-го типа она осталась прежней (р>0,05), а в макрофагах и эндотелии значительно снизилась (р=0,000 и р=0,003 соответственно). Синтез фермента в альвеолоцитах 1-го типа не менялся, оставаясь крайне низким (р=0,44). В контрольной группе через 3 сут экспрессия ММР-2 была одинаково низкой во всех клетках: на уровне 1 балла в 8—16% полей зрения (р=0,34).

Через 6 сут после введения лизата фиксировались морфологические маркеры фибротической фазы ОПЛ/ОРДС [1, 10]: увеличение объема соединительной ткани в интерстиции легких, утолщение стенок альвеол, в том числе и за счет реэпителизации и пролиферации альвеолоцитов. Кроме того, определялись изменения в интиме артериол в виде гипертрофии мышечного слоя, в единичных случаях вплоть до их полной облитерации. В этой стадии синдрома экспрессия фермента эндотелием и фибробластами оставалась на уровне II фазы ОПЛ/ОРДС (р>0,05), а в нейтрофилах (р=0,002 по сравнению с I фазой), макрофагах (р=0,03) и альвеолоцитах 2-го типа (р=0,02) уменьшалась. Различий в уровне экспрессии энзима альвеолоцитами 1-го типа во всех фазах ОПЛ/ОРДС не было (табл. 3).

В контрольной группе через 6 сут уровень экспрессии металлопротеиназы по сравнению с предыдущим периодом не менялся.

При развитии ОПЛ/ОРДС, как и в контрольной группе, TIMP-2 синтезировали те же клетки, что и ММР-2, однако динамика экспрессии ингибитора отличалась. Макрофаги в контроле экспрессировали TIMP-2 на уровне 1—2 баллов в 8—12% полей зрения неизменно во все временные периоды эксперимента (р=0,09). При развитии ОПЛ/ОРДС синтез ингибитора в них не менялся (р=0,46). Экспрессия ингибитора нейтрофилами в контрольной группе была крайне низкой — 1—2 балла в 4%, не меняясь во всех временных точках эксперимента, а при развитии ОПЛ/ОРДС повышалась и достигала уровня 1—2 балла в 20% полей зрения (р=0,031), но также не зависела от фазы синдрома (р=0,06). Альвеолоциты 1-го типа в контроле не экспрессировали TIMP-2, при развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия фермента фиксировалась на уровне 1 балла в 4—8% полей зрения, значимо не отличаясь от контроля (р=0,066).

Фибробласты в контрольной группе, напротив, экспрессировали ингибитор достаточно активно: 1—2 балла — в 16—30% и 3—4 балла — в 4% исследуемых полей зрения. При ОПЛ/ОРДС экспрессия нарастала до 1—2 баллов в 45—60% полей и до 3—4 баллов — в 12—16% полей зрения (р=0,05), но от фазы синдрома не зависела (р=0,2). Эндотелиоциты экспрессировали TIMP-2 достаточно активно (1—2 балла в 30—32%), но парадоксально отвечали на введение 0,9% раствора NaCl: происходило значимое угнетение экспрессии ингибитора до 1—2 баллов в 16—20% полей зрения в течение 72 ч (р=0,04). При развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия эндотелием TIMP-2 значительно повышалась и достигала уровня 1—2 балла в 46—52% и 3—4 балла — в 12—16% полей зрения (р=0,000), но от фазы синдрома также не зависела (р=0,61). Альвеолоциты 2-го типа, экспрессируя TIMP-2 в контроле на уровне 1—2 баллов в 22% и 3—4 баллов — в 6%, также реагировали угнетением синтеза энзима в ответ на введение 0,9% раствора NaCl в течение 72 ч до 1—2 баллов в 8—10% полей зрения (р=0,02 при сопоставлении с базовой экспрессией). При развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия TIMP-2 в альвеолоцитах 2-го типа оставалась на уровне контроля во всех фазах (р=0,68).

Основная функция ММР-2 — расщепление нефибриллярного коллагена базальных мембран (коллагена IV типа), эластина, фибронектина [7]. TIMP-2 способен как непосредственно ингибировать ММР-2, так и через инактивацию мембранной ММР-14, которая переводит ММР-2 в активную форму [5]. Баланс между этими ферментами необходим для адекватной пролиферации и дифференцировки клеток при репарации.

Полученные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о следующих процессах. В контроле ММР-2 одинаково экспрессировали все описанные клетки. TIMP-2 синтезировался неравномерно: интенсивнее в эндотелии и фибробластах. Такое соотношение синтеза ферментов, по-видимому, поддерживает равновесие в системе ММР-2/TIMP-2. В ответ на минимальное воздействие (эндотрахеальное введение 0,9% раствор NaCl) через 24 ч эндотелиоциты и альвеолоциты 2-го типа реагировали повышением экспрессии ММР-2 более чем в 2 раза, на фоне угнетения в них синтеза TIMP-2. Повреждения в итоге не наступило, следовательно, такие колебания не нарушают равновесия в системе, а эндотелиоциты и альвеолоциты 2-го типа наиболее чутко реагируют на воздействие повреждающих факторов смещением в системе ММР-2/TIMP-2 в сторону повышения протеолитической активности.

Резкий (в 3—4 раза) прирост экспрессии ММР-2 в экссудативной фазе ОПЛ/ОРДС на фоне менее выраженного синтеза TIMP-2, вероятно, смещает равновесие в сторону избыточного протеолиза, что вносит свой вклад в повреждение аэрогематического барьера. Менее значимый перевес металлопротеиназы в системе ММР-2/TIMP-2 в пролиферативной стадии синдрома, возможно, поддерживает необходимое в этот момент умеренное повышение уровня протеазы в локусе воспаления. Есть данные, что ММР-2 при умеренном повышении концентрации активирует трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и параллельно разрушает важнейший провоспалительный цитокин интерлейкин-1β (ИЛ-1β) [5, 7]. Следовательно, в этой стадии синдрома ММР-2 препятствует адгезии нейтрофилов к эндотелию и их гиперактивации (нивелируются свойства ИЛ-1β, разрушается фибронектин), а также опосредованно участвует в привлечении в очаг моноцитов крови (TGF-β является их хемоаттрактантом). В III фазе ОПЛ/ОРДС наблюдался сдвиг в системе в сторону TIMP-2 (экспрессия ММР-2 уменьшалась, а ингибитора оставалась неизменной), что, безусловно, влияет на развитие фибротических изменений в легких.

Таким образом, в каждой стадии развития ОПЛ/ОРДС соотношение в системе ММР-2/TIMP-2 имеет свои особенности и вносит вклад как в повреждение альвеолярно-капиллярной мембраны, так и в развитие фиброза в исходе процесса.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail