Постовалова Е.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Министерства науки и высшего образования РФ, Москва, Россия

Макарова О.В.

Государственная новосибирская областная клиническая больница

Косырева А.М.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Министерства науки и высшего образования РФ, Москва, Россия

Михайлова Л.П.

ФГБНУ «НИИ морфологии человека», Москва, Россия

Морфология тимуса и особенности его клеточного состава при экспериментальном остром и хроническом язвенном колите

Журнал: Архив патологии. 2019;81(5): 53-63

Просмотров : 66

Загрузок : 2

Как цитировать

Постовалова Е. А., Макарова О. В., Косырева А. М., Михайлова Л. П. Морфология тимуса и особенности его клеточного состава при экспериментальном остром и хроническом язвенном колите. Архив патологии. 2019;81(5):53-63. https://doi.org/10.17116/patol20198105153

Авторы:

Постовалова Е.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Министерства науки и высшего образования РФ, Москва, Россия

Все авторы (4)

При различных острых и хронических воспалительных заболеваниях в тимусе развиваются стереотипные реакции, которые морфологически проявляются акцидентальной инволюцией [1—3]. Акцидентальная инволюция тимуса характеризуется прогрессирующим снижением его массы и изменением функциональной активности [3—5]. Выраженность акцидентальной инволюции тимуса зависит от тяжести воспалительного процесса, а также исходного генофенотипически обусловленного функционального состояния иммунной системы. Морфологические проявления акцидентальной инволюции детально охарактеризованы в отечественных работах Т.Е. Ивановской и соавт. (1996) и О.В. Зайратьянца (1998) [3, 6]. В отличие от отечественной в зарубежной литературе выделяют гиперплазию тимуса, острую и хроническую инволюцию [4, 5, 7, 8].

В последнее 10-летие в связи с расширением представлений об иммунологических механизмах толерантности возобновился интерес к изучению тимуса и, в частности, к установлению функциональной роли его эпителиальных клеток. Эпителиальные клетки субкапсулярного, коркового и мозгового вещества тимуса имеют сходную звездчатую форму, но они различаются на ультраструктурном уровне, выделяют светлые и темные клетки соответственно экто- и эндодермального происхождения [9]. По функциональным параметрам различают секреторные клетки, являющиеся источником тимических гормонов и гуморальных факторов, таких как цитокины и хемокины, и поддерживающие клетки. Следует отметить, что функция эпителиальных клеток тимуса может изменяться в зависимости от их микроокружения [10].

Функции тимуса реализуются благодаря контактным взаимодействиям эпителиальных клеток, в основе которых лежит взаимное распознавание лигандов и рецепторов дифференцировочных факторов семейства Notch [11]. Помимо этого, межклеточная адгезия, в частности контакты эпителиальных и лимфоидных клеток тимуса, обеспечивается молекулой CD2. У человека она присутствует на поверхности практически всех зрелых T-лимфоцитов и NK-клеток, а у мышей CD2 экспрессируется также на B-лимфоцитах, которые в норме присутствуют в мозговом веществе тимуса [12]. Контррецептором CD-2 на поверхности различных клеток человека (стромальных, макрофагов, лимфоцитов, клеток эпителия и др.) служит белок LFA-3 (CD58), заякоренный в мембране с помощью фосфатидилинозитола [13]. Также на поверхности эпителиальных клеток есть рецепторы β1-интегрина (ICAМ-1) и β2-интегрина (VCAM-1), взаимодействующие с интегринами β1 (LFA-1) и β2 (VLA-4 — Verylate antigen-4) и VLA-6 на поверхности тимоцитов [14]. Контакты между эпителиальными и лимфоидными клетками важны для передачи ростовых и дифференцировочных сигналов при осуществлении селекции. Кортикальные эпителиальные клетки отвечают за положительную, а медуллярные — за отрицательную селекцию Т-лимфоцитов за счет экспрессии на их поверхности молекул MHC-I и MHC-II.

В мозговом веществе тимуса расположены особые морфологические структуры, образованные эпителиальными клетками, тимические тельца, отличающиеся от других медуллярных клеток мембранными маркерами и секретируемыми гуморальными факторами. Тимические тельца у человека и некоторых животных описаны как многослойные чешуйчатые скопления эпителиальных клеток с отложениями кератогиалина в центре. Клетки тимических телец относятся к светлым и имеют эктодермальное происхождение [3]. Установлено, что эпителиальные клетки тимических телец секретируют цитокин-тимический стромальный лимфопоэтин (Thymic Stromal Lymphopoietin — TSLP), влияющий на дендритные клетки, базофилы, эозинофилы, тучные клетки, натуральные киллеры, В-лимфоциты, эпителиальные клетки, а также на корецепторы, представленные на мембране Т-лимфоцитов, CD4, CD8 [15]. Дендритные клетки, активированные TSLP, играют ключевую роль в процессе дифференцировки регуляторных Т-клеток. Кроме того, они индуцируют дифференцировку аллергического варианта Th2-клеток, блокируют Th1-/Th17-иммунный ответ, индуцируя развитие аутоиммунных заболеваний [10, 15].

Функции эпителиальных клеток тимуса реализуются также через выделяемые ими гуморальные факторы, такие как цитокины и хемокины. В тимусе образуется IL-7, главный лимфопоэтический фактор, необходимый для запуска перестройки гена γ-цепи TCR, происходит усиление пролиферации зрелых Т-клеток и секреции IFNγ Т-лимфоцитами по принципу положительной обратной связи [16]. Провоспалительные цитокины IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, продуцируемые в тимусе, выполняют функцию дифференцировочных факторов, оказывая действие в комбинации друг с другом.

Несмотря на обширные знания о морфофункциональном состоянии тимуса в условиях физиологической нормы, в литературе представлены единичные работы, посвященные изучению его акцидентальной инволюции вообще и эпителиального компонента в частности при различных патологических процессах. В обзоре J. Berthelot и соавт. [17] представлены данные литературы, свидетельствующие о том, что при таком воспалительном заболевании, как ревматоидный артрит, у человека увеличивается количество тимических телец и изменяется их функциональная активность. Нарушения взаимодействия эпителия тимуса и регуляторных Т-лимфоцитов, наблюдаемые у пациентов с ревматоидным артритом, могут приводить к изменению репертуара регуляторных Т-лимфоцитов на периферии и к инволюции Т-клеточного звена иммунной системы, с последующим повышением содержания эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов и регуляторных Т-лимфоцитов в периферической крови.

В последние годы показана важная роль регуляторных Т-лимфоцитов в развитии различных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как сахарный диабет 1-го типа, системная красная волчанка, туберкулез, псориаз, дерматомиозит, воспалительные заболевания кишечника и, в частности, язвенный колит [18]. Однако на клиническом материале исследование тимуса невозможно, поэтому для оценки его морфологических изменений широко используют экспериментальные модели заболеваний человека, в частности модели язвенного колита. В ряде работ при язвенном колите у человека в периферической крови и стенке ободочной кишки выявлено увеличение числа дифференцированных в тимусе регуляторных Т-лимфоцитов [19], что рассматривается как один из возможных дополнительных диагностических критериев заболевания. Данные литературы об изменении тимуса у половозрелых мышей линии C57BL/6 при язвенном колите ограничиваются работой S. Sasaki и соавт. [4], в которой показано прогрессирующее снижение массы тимуса и числа CD4+CD8+ тимоцитов в нем.

Следует отметить, что акцидентальная инволюция тимуса — это сложный и еще не в полной мере изученный процесс. Так, в литературе отсутствуют сведения о взаимосвязи морфологических изменений тимуса с субпопуляционным составом лимфоцитов и его нелимфоидных клеток: эпителиальных, дендритных и макрофагов.

Материал и методы

Работа выполнена на 68 половозрелых самцах мышей линии C57BL/6 с массой тела 18—20 г, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства. Животных содержали по 10 особей в клетке в стандартных условиях вивария. Мыши имели свободный доступ к питьевой воде и брикетированному корму ПК-120−1 (ООО «Лабораторснаб»). При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.77. На проведение исследования получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУН «НИИ морфологии человека».

С целью моделирования острого и хронического язвенного колита (ХЯК) мыши опытных групп получали вместо питьевой воды 1% водный раствор декстрансульфата натрия — ДСН (Mr ~40,000, «BioChemica», Германия).

Для моделирования острого (n=12) и раннего срока хронического язвенного колита (ХЯК) животные (n=22) получали 1% водный раствор ДСН в течение первых 5 сут эксперимента, затем животные с острым колитом были выведены из эксперимента на 7-е сутки, а с ранним сроком развития ХЯК на 28-е сутки эксперимента. Поздний срок ХЯК (n=16) моделировали путем курсового интервального потребления животными 1% водного раствора ДСН на 1—5, 11—15 и 21—26-е сутки, животные этой группы были выведены из эксперимента на 56-е сутки. Средний суточный объем потребляемого раствора ДСН на каждую мышь варьировал от 4,2 до 5,1 мл. Мыши контрольных групп (n=18) получали питьевую воду и были выведены из эксперимента на 7-е и 56-е сутки.

Для морфологического исследования дистальный отдел ободочной кишки и тимус фиксировали в жидкости Буэна, проводили по спиртовым растворам восходящей концентрации и ксилолам в аппарате Tissue-Tek VIP5Jr («Sakura», США). Обезвоженные образцы заливали в гистомикс на аппарате Tissue-Tek TEC («Sakura», США). С блоков на микротоме модели Microm HM340E («ThermoScientific», США) изготовляли срезы толщиной 4—6 мкм, монтировали их на предметные стекла, депарафинировали и затем окрашивали гематоксилином и эозином.

На окрашенных гематоксилином и эозином гистологических срезах оценивали объемную плотность структурно-функциональных зон тимуса методом точечного счета под световым микроскопом Leica DM2000 (Германия) при увеличении 200. В гистологических срезах тимуса подсчитывали количество тимических телец, состоящих из 3—7,7 и более эпителиальных клеток, с отложениями кератогиалина и тимических телец в виде кистоподобных полостей.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили с использованием иммунопероксидазного метода. Цитокератин-19-положительные эпителиальные клетки в мозговом веществе тимуса выявляли с помощью антител Rabbitmonoclonal [EP1580Y] Anti-Cytokeratin 19 antibody, «Abcam» (Великобритания) в разведении 1:200; Goat F (ab’)2 Anti-Rabbit IgG (Fab’)2 (HRP), «Abcam» (Великобритания) в разведении 1:400. Для каждого ИГХ-исследования ставили отрицательный и положительный контроль.

На микрофотоснимках препаратов с ИГХ-реакцией с антителами к цитокератину-19 проводили выделение каналов 3,3’-диаминобензидина и гематоксилина с использованием функции Colordeconvolution и стандартных векторов H+DAB. Пороговую сегментацию осуществляли с применением алгоритмов AutoThreshold и Autolocalthreshold. Применяли анализ частиц Analyzeparticles. Оценивали абсолютную площадь тимических телец, состоящих из цитокератин-19-положительных эпителиальных клеток.

Для иммунофенотипического исследования суспензию лимфоцитов тимуса получали с помощью гомогенизатора Поттера в культуральной среде RPMI 1640 («Gibco», Великобритания), клеток стромы тимуса — методом ферментативной дезагрегации по Y. Xing, K. Hogquist. Фрагменты тимуса инкубировали в трех сменах культуральной среды RPMI 1640 («Gibco», Великобритания), содержащей коллагеназу D, выделенную из Clostridium histolyticum («Roche», Швейцария), диспазу 2, полученную из Bacillus polymyxa («Roche», Швейцария), ДНКазу 1 («ThermoScientific», США), затем суспензию клеток для нейтрализации действия ферментов переносили в буфер, состоящий из культуральной среды RPMI 1640 («Gibco», Великобритания), бычьего сывороточного альбумина («Sigma Aldrich», США) и ЭДТА («Sigma Aldrich», США).

Субпопуляционный состав лимфоцитов и клеток стромы тимуса определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США), использовали антитела CD3e-FITC, CD4-PE-Cy5, CD8a-PE-Cy7, CD19-PE, F4/80-PE, CD11c-PE, CD45-FITC, CD205-PE, CD326 (EpCAM)-PE-Cy7 («eBioscience», США), UEA1-FITC («Vector Laboratories», США). Выявление субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов и гибнущих клеток проводили в соответствии с протоколами с помощью наборов MouseRegulatoryT-CellStainingKit #3 («eBioscience», США) и Annexin V-FITC kit («Beckman Coulter», Франция). Абсолютное количество клеток в суспензии тимуса подсчитывали в камере Горяева.

Проводили статистическую обработку полученных данных в программе StatSoft Statistica 10. Поскольку экспериментальные группы были небольшими (10—22 животных в группе) и исследуемые параметры, как правило, по результатам теста χ2 были распределены ненормально, использовали методы непараметрической статистики. Вычисляли медиану и интерквартильный размах (Med (25—75%), для сравнения групп использовали дисперсионный анализ Краскела—Уоллиса и U-критерий Манна—Уитни. Различия считали статистически значимыми при вероятности ошибки p<0,05.

Результаты

Потребление животными 1% водного раствора ДСН в течение первых 5 сут эксперимента на 7-е сутки приводило к индукции острого язвенно-воспалительного процесса, ограничивающегося толстой кишкой. Развитие патологического процесса проявлялось диареей с кровью, снижением массы тела и ухудшением общего состояния животных. В ободочной кишке была выявлена картина острого катарально-язвенного колита, проявления которого в разных зонах дистального отдела ободочной кишки варьировали от минимально до максимально выраженных. В зонах ободочной кишки с максимально выраженными альтеративными и воспалительными изменениями выявлены язвы, дно которых было заполнено массивными скоплениями лейкоцитов и небольшими отложениями эозинофильных масс фибрина у 2 из 14 животных. Собственная пластинка слизистой оболочки (СПСО) в этих зонах замещена грануляционной тканью с большим количеством тонкостенных сосудов и выраженной воспалительной инфильтрацией макрофагами, лимфоцитами, нейтрофилами (рис. 1, а).

Рис. 1. Морфологическая характеристика ободочной кишки у мышей контрольной и экспериментальной групп. а — контрольная группа: эпителиальная выстилка не нарушена, просветы крипт узкие, много бокаловидных клеток, в соединительной ткани СПСО небольшое количество клеток, в ее базальных отделах лимфатические сосуды со щелевидным просветом; б — острый язвенный колит: на поверхности язвы слизь, СПСО замещена грануляционной тканью с выраженной воспалительной инфильтрацией, отек и диффузная воспалительная инфильтрация подслизистого слоя; в — хроничеcкий язвенный колит, 28-е сутки развития: эпителизирующаяся язва, регенераторные изменения: эпителий крипт высокий, цилиндрический, с гиперхромными ядрами, выраженная воспалительная инфильтрация; г, д — хронический язвенный колит, 56-е сутки развития; г — эпителизирующаяся язва, регенераторные изменения, выраженная воспалительная инфильтрация; д — в СПСО выраженная воспалительная инфильтрация, преимущественно плазмоцитами. Окраска гематоксилином иэозином.

При морфологическом исследовании тимус половозрелых животных контрольных групп (на 7-е и 56-е сутки) соответствовал физиологической норме (рис. 2, а).

Рис. 2. Морфологическая характеристика тимуса у половозрелых самцов мышей линии C57BL/6 контрольной группы (а, б) и с острым язвенным колитом (в, г). а — корковое вещество плотно заселено лимфоцитами, границы между корковым и мозговым веществом четкие; в, г — острая акцидентальная инволюция; в — границы коркового и мозгового вещества очагово-нечеткие, тимические тельца в виде кистоподобных полостей в корковом веществе и на границе коркового и мозгового вещества; б, г — тимические тельца, образованные цитокератин-19-позитивными эпителиальными клетками. а, в — окраска гематоксилином и эозином; б, г – ИГХ-реакция с антителами к цитокератину-19.
Статистически значимых различий показателей субпопуляций лимфоцитов тимуса и его нелимфоидных клеток между контрольными группами выявлено не было, что позволило объединить контрольные группы разных серий экспериментов.

При морфологическом исследовании в тимусе у половозрелых самцов с острым язвенным колитом выявлена острая акцидентальная инволюция (ОАИ). По сравнению с животными контрольной группы при ОАИ корковое вещество было сужено (см. рис. 2, в). Соотношение коркового и мозгового вещества составило 1:1 (рис. 3).

Рис. 3. Морфометрические показатели объемной доли коркового вещества. Статистически значимые различия: * — по сравнению с контрольной группой, # — с группой острого язвенного колита.
Корковое вещество очагово опустошено, в части долек выявлялась картина «звездного неба». Границы между корковым и мозговым веществом очагово-нечеткие.

По данным проточной цитофлуориметрии в тимусе по сравнению с животными контрольной группы при ОАИ снижалось абсолютное количество лимфоцитов, CD4+CD8+незрелых дубль-позитивных Т-лимфоцитов, CD3+ CD4+ Т-хелперов, CD3+ CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и CD4+ CD25+ Foxp3+и регуляторных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов (табл. 1),

Таблица 1. Субпопуляционный состав лимфоцитов в тимусе у половозрелых самцов мышей линии C57BL/6 контрольной группы с острым и хроническим язвенным колитом (Me 25—75%)
но увеличивалось относительное содержание гибнущих по механизму апоптоза Ann+PI--клеток (контроль — 8,2 (1,6; 9,7); ОАИ — 10,0 (8,8; 10,4); p=0,03).

В мозговом веществе при морфологическом исследовании определялись многочисленные тимические тельца, их относительная площадь при ОАИ была выше, чем у животных контрольной группы (контроль — 1,9 (1,4; 2,2); ОАИ —3,9 (2,9; 4,9); p=0,0004). При ОАИ появлялись тимические тельца в виде кистоподобных полостей. По сравнению с контрольной группой при ОАИ увеличивалась доля тимических телец с отложениями кератогиалина (рис. 4),

Рис. 4. Морфометрические показатели доли каждого типа тимических телец от общего количества тимических телец. Статистически значимые различия: * — по сравнению с контрольной группой, # — с группой острого язвенного колита.
а также площадь тимических телец, состоящих из CK19+-эпителиальных клеток (контроль — 154,5 мкм2 (50,2; 214,2); ОАИ — 201,3 мкм2 (153,3; 472,4); p=0,05) (см. рис. 2, б, г).

По данным проточной цитофлуориметрии при ОАИ соотношение эпителиальных клеток коркового (СD326+UEACD205+) и мозгового вещества (СD326+UEA+CD205) не отличалось от такового у животных контрольной группы, в то время как содержание CD45+CD4CD8CD11c+-дендритных клеток снижалось (табл. 2).

Таблица 2. Показатели нелимфоидных клеток (в %) в тимусе у половозрелых самцов мышей линии C57BL/6 контрольной группы с острым и хроническим язвенным колитом (Me 25— 75%)

Таким образом, по данным морфологического, морфометрического, иммуногистохимического исследований и проточной цитофлуориметрии при остром катарально-язвенном колите развивается умеренная ОАИ тимуса, характеризующаяся опустошением и уменьшением объемной доли коркового вещества, увеличением содержания гибнущих по механизму апоптоза клеток, снижением абсолютного количества всех исследуемых субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, увеличением показателя площади тимических телец и содержания среди них телец поздних фаз развития, состоящих из 7 и более эпителиальных клеток с отложениями кератогиалина, и появлением тимических телец в виде кистоподобных полостей.

На 28-е сутки (ранний срок) эксперимента острый язвенный колит хронизировался, в ободочной кишке крипты деформированы, их просветы расширены, местами заполнены слизью, в СПСО наблюдались очаговый отек, выраженная диффузная и очаговая воспалительная инфильтрация, состоящая из лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов и единичных нейтрофилов, очаговый фиброз (см. рис. 1, в). На 56-е сутки (поздний срок) после курсового интервального потребления животными 1% ДСН в толстой кишке выявлена картина ХЯК, наблюдались изменения, характерные для язвенного колита человека: деформация крипт, небольшие острые и эпителизированные язвы с регенераторными изменениями крипт в их краях, выраженная воспалительная инфильтрация базального отдела СПСО преимущественно плазмоцитами, склероз СПСО и подслизистой основы (см. рис. 1, г, д).

При морфологическом исследовании на 28-е и 56-е сутки развития ХЯК в тимусе выявлялась гиперплазия коркового вещества, объемная доля которого была выше, чем у животных контрольной группы и с острым язвенным колитом (см. рис. 3). У 2 из 16 животных на 56-е сутки ХЯК развивалась выраженная ОАИ, характеризующаяся опустошением коркового вещества, картиной «звездного неба», очаговой нечеткостью границ между корковым и мозговым веществом (рис. 5, а,

Рис. 5. Морфологическая характеристика тимуса у половозрелых самцов мышей C57BL/6 с хроническим язвенным колитом в разные сроки развития. а, б — хронический язвенный колит, 28-е сутки развития; а — границы коркового и мозгового вещества очагово-нечеткие, в корковом веществе выявляется скопление тимических телец в виде кистоподобных полостей; в, г — хронический язвенный колит, 56-е сутки развития; в — корковое вещество очагово неплотно заселено лимфоцитами, границы между корковым и мозговым веществом очагово-нечеткие, на границе коркового и мозгового вещества гигантское тимическое тельце; б — тимические тельца в виде кистоподобных полостей, образованные цитокератин-19-позитивными эпителиальными клетками; г — тимическое тельце, состоящее из скопления цитокератин-19-позитивных эпителиальных клеток, и тимическое тельце на начальном этапе формирования кистоподобной полости. а, в — окраска гематоксилином и эозином; б, г — ИГХ-реакция с антителами к цитокератину-19.
в).

По данным проточной цитофлуориметрии в тимусе по сравнению с животными контрольной группы в оба срока ХЯК снижалось абсолютное число CD3-CD19+ В-лимфоцитов. Количество CD4+CD8+-незрелых дубль-позитивных лимфоцитов было ниже на 28-е сутки по сравнению с 56-ми сутками ХЯК (см. табл. 1).

Мозговое вещество тимуса при морфологическом исследовании опустошено, в нем выявлялись эпителиальные клетки и лимфоциты, причем лимфоциты преобладали. В мозговом веществе определялись многочисленные тимические тельца, состоящие из 3—7 и более эпителиальных клеток, с отложениями кератогиалина и виде кистоподобых полостей (см. рис. 4). По данным морфометрической оценки, относительная площадь тимических телец в мозговом веществе была выше в поздний срок ХЯК по сравнению с таковой у животных контрольной группы и в ранний срок ХЯК (контроль — 1,9 (1,4; 2,2); ранний срок ХЯК — 2,1 (1,1; 3,0); поздний срок ХЯК — 3,3 (2,8; 4,6);pк-56=0,0003 и p28–56=0,001). По сравнению с животными контрольной группы в поздний срок ХЯК доля тимических телец, состоящих из 7 и более эпителиальных клеток, от общего количества тимических телец была выше (см. рис. 4). По сравнению с животными контрольной группы площадь тимических телец, состоящих из CK19+-эпителиальных клеток, повышалась только на 56-е сутки развития ХЯК (контроль — 154,5 (50,2; 214,2); ранний срок ХЯК — 163,5 (109,0; 298,6); поздний срок ХЯК — 185,7 мкм2 (122,7; 310,7); pк-56=0,01), а их количество увеличивалось в ранний и поздний сроки развития (контроль — 1,0 (0; 1,0); ранний срок ХЯК — 6,0 (3,0; 7,0); поздний срок ХЯК — 4,5 (2,5; 6,0); pк-28=0,001 и pк-56=0,001) (см. рис. 5, б, г).

Тимические тельца в виде кистоподобных полостей определялись в оба срока развития ХЯК и были локализованы не только в корковом и мозговом веществе, но и на их границе. В ранний срок развития ХЯК у 6 животных из 22 тимические тельца в виде кистоподобных полостей формировали «розетки» — скопления из 3 кист и более, при этом по данным морфометрического исследования относительная площадь кистоподобных полостей мозгового вещества и их доля от общего количества тимических телец достоверно не отличались в ранний и поздний сроки развития ХЯК.

По данным проточной цитофлуориметрии, содержание СD326+UEA+CD205-эпителиальных клеток в мозговом веществе по сравнению с таковым у животных контрольной группы увеличивалось в оба срока развития ХЯК и было максимальным в поздний срок ХЯК (табл. 2). Содержание дендритных клеток увеличивалось только на 28-е сутки ХЯК.

Таким образом, морфологическое, морфометрическое и иммуногистохимическое исследования, а также данные, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии, показали, что при ХЯК у половозрелых самцов мышей линии C57BL/6 развивается гиперплазия коркового вещества и эпителиальных клеток мозгового вещества, более выраженная по сравнению с ранним сроком (28-е сутки) в поздний срок (56-е сутки) развития ХЯК. У 2 самцов в поздний срок ХЯК выявлена выраженная акцидентальная инволюция тимуса, характеризующаяся резким опустошением коркового и мозгового вещества, нечеткостью границ между ними.

Обсуждение

Работа посвящена изучению изменений морфофункционального состояния тимуса у половозрелых самцов мышей линии C57BL/6 при остром язвенном колите и в разные сроки развития ХЯК.

При остром катарально-язвенном колите при морфологическом и морфометрическом исследованиях в тимусе выявлена ОАИ с опустошением и уменьшением объемной доли коркового вещества, гиперплазией тимических телец и увеличением среди них телец с отложениями кератогиалина и появлением кистоподобных полостей. Выявленные реактивные изменения тимуса характерны для острой фазы воспалительного процесса, индуцированного липополисахаридом [20]. Данные литературы об изменении тимуса при экспериментальном остром язвенном колите ограничиваются работой S. Sasaki и соавт. [4], в которой авторы выявили снижение массы тимуса у половозрелых мышей линии C57BL/6 на 7-е сутки развития язвенного колита, индуцированного ДСН.

Выявленное уменьшение числа Т-хелперов, цитотоксических и регуляторных Т-лимфоцитов, по-видимому, связано с усилением их миграции и гибели, а также торможением дифференцировки из-за уменьшения количества незрелых дубль-позитивных лимфоцитов [21]. По нашим данным, по сравнению с животными контрольной группы при ОАИ содержание аннексинv+PI- гибнущих по механизму апоптоза клеток тимуса в 1,2 раза выше, а незрелых CD4+CD8+ Т-лимфоцитов в 4 раза ниже. Полученные данные о снижении абсолютного числа В-лимфоцитов в тимусе отражают уменьшение содержания этой субпопуляции лимфоцитов в периферической крови, что было показано ранее [22].

Наряду с оценкой субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса при ОАИ впервые был проведен комплексный анализ его нелимфоидных клеток: морфометрическое исследование разных типов тимических телец, иммуногистохимическая оценка количества и площади тимических телец, состоящих из цитокератин-19-положительных эпителиальных клеток, а также с помощью проточной цитофлуориметрии анализ субпопуляций эпителиальных клеток мозгового и коркового вещества, дендритных клеток и макрофагов.

По данным комплексного морфометрического исследования на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином и антителами к цитокератину-19, в мозговом веществе тимуса при ОАИ увеличиваются количество и площадь тимических телец. Среди них преобладают тельца, состоящие из 3—7 эпителиальных клеток, появляются тельца в виде кистоподобных полостей.

По данным литературы [3] прошлых лет, тимические тельца представляют терминальный этап дифференцировки эпителиальных клеток тимуса. Сейчас считается, что их количество и размеры служат показателем секреторной активности [23]. Тимические тельца, секретирующие TSLP, играют ключевую роль в позитивной селекции Т-лимфоцитов, опосредованной дендритными клетками, что в первую очередь необходимо для дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов тимуса [10, 15, 17].

При ОАИ по сравнению с контролем показано увеличение в 3 раза доли тимических телец с отложениями кератогиалина. Появление фибрилл кератина в кератиноцитах тимических телец связано с преобразованием гибнущих эпителиальных клеток в так называемые чешуи. Кератинизация может быть снижена, но не блокирована ингибиторами трансглутаминазы или каспазы-14 [24].

Среди нелимфоидных клеток тимуса при ОАИ снижается содержание CD45+CD4CD8CD11c+-дендритных клеток, что может быть следствием их усиленной миграции в периферические органы иммунной системы и очаг воспаления или гибели наряду с Т-лимфоцитами коркового и мозгового вещества тимуса.

Дендритные клетки мозгового вещества тимуса несут на своей поверхности собственные антигенные пептиды организма в составе белков главного комплекса гистосовместимости и осуществляют процесс отрицательной селекции созревающих Т-лимфоцитов и тем самым участвуют в регуляции центральной аутотолерантности [25]. Снижение их содержания также может влиять на нарушение дифференцировки Т-лимфоцитов в тимусе.

В тимусе при ХЯК выявлена гиперплазия коркового вещества и эпителиальных клеток, более выраженная на 56-е сутки развития. Реактивные изменения тимуса — гиперплазия его коркового вещества чаще всего ассоциирована с миастенией гравис, но также наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка, ревматоидный артрит и склеродермия [17, 18].

В ранний срок развития ХЯК (28-е сутки) в тимусе уменьшается содержание цитотоксических Т-лимфоцитов, увеличивается количество эпителиальных клеток мозгового вещества, дендритных клеток, уменьшается число эпителиальных клеток мозгового вещества. В поздний срок ХЯК (56-е сутки) в тимусе по сравнению с контролем увеличивается содержание эпителиальных клеток мозгового вещества, уменьшается количество эпителиальных клеток коркового вещества и макрофагов. Выявленные при морфологическом и морфометрическом исследовании изменения тимуса свидетельствуют о восстановлении коркового вещества за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки тимоцитов, что характерно, как показано О.В. Макаровой и соавт. [2], для хронического воспалительного процесса, индуцированного подкожным введением липополисахарида с частицами сефарозы.

Выявленная при морфологическом исследовании в тимусе животных острая и хроническая акцидентальная инволюция является стереотипным реактивным процессом, который развивается при патологических стрессах и воспалительных заболеваниях разной тяжести. Нами впервые была показана гиперплазия эпителиальных клеток мозгового вещества и тимических телец, состоящих из цитокератин-19+-эпителиальных клеток, при обеих формах акцидентальной инволюции. Более выраженная реакция со стороны эпителиальных клеток обнаружена в поздний срок развития ХЯК, что косвенно отражает усиление дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов, увеличение числа которых выявлено ранее в эксперименте [26] и согласуется с данными литературы [19] о повышении этой субпопуляции в периферической крови и очаге воспаления у больных язвенным колитом.

Заключение

Острая акцидентальная инволюция тимуса, развивающаяся при экспериментальном остром язвенном колите, характеризуется опустошением и уменьшением объемной доли коркового вещества, увеличением содержания гибнущих по механизму апоптоза клеток, снижением абсолютного количества лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических и регуляторных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, увеличением показателя площади тимических телец и содержания среди них телец поздних фаз развития, состоящих из 7 и более эпителиальных клеток, с отложениями кератогиалина, появлением тимических телец в виде кистоподобных полостей, снижением содержания дендритных клеток.

Гиперплазия коркового вещества тимуса и его эпителиальных клеток, развивающаяся при экспериментальном хроническом язвенном колите в ранний и поздний сроки его развития, характеризуется расширением коркового вещества, увеличением площади тимических телец и содержания эпителиальных клеток мозгового вещества, появлением тимических телец в виде кистоподобных полостей и формированием «розеток» — скопления 3 кист и более в ранний срок развития ХЯК. В ранний срок развития ХЯК повышено содержание дендритных клеток, в оба срока развития ХЯК снижено содержание макрофагов.

Острая и хроническая акцидентальная инволюция тимуса сопровождается гиперплазией эпителиальных клеток мозгового вещества и тимических телец.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.В.М., Е.А.П.

Сбор и обработка материала — Е.А.П., А.М.К.

Статистическая обработка — Е.А.П.

Написание текста — Е.А.П., О.В.М.

Редактирование — О.В.М., Е.А.П., А.М.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Постовалова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-3413-3122, e-mail: e.a.postovalova@gmail.com;

Макарова О.В. — https://orcid.org/0000-0001-8581-107X;

Косырева А.М. — https://orcid.org/0000-0002-6182-1799;

Михайлова Л.П. — https://orcid.org/000-0002-0479-8664

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Постовалова Е.А., Макарова О.В., Косырева А.М., Михайлова Л.П. Морфология тимуса и особенности его клеточного состава при экспериментальном остром и хроническом язвенном колите. Архив патологии. 2019;81(5):53-63. https://doi.org/10.17116/patol20198105153

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail