Врожденные деформации грудной клетки (ВДГК) — группа заболеваний, включающая различные виды мальформаций ее передней стенки, которые могут вызывать осложнения со стороны сердечно-сосудистой системы или легких [1]. К наиболее распространенным деформациям относятся воронковидная (pectus excavatum) и килевидная (pectus carinatum) деформация (соответственно ВД и КД) грудной клетки [1, 2]. Предполагают, что основной причиной их развития являются морфологические изменения реберных хрящей, однако результаты исследований немногочисленны и противоречивы [3]. Лишь единичные работы посвящены хондроцитам, а хрящевые каналы, содержащие кровеносные и лимфатические сосуды, при ВДГК практически не изучены [4]. Кроме того, в большинстве проведенных исследований авторы [1, 3] не использовали морфометрию, в связи с чем невозможно судить о достоверности выявленных ими различий между нормальной грудной клеткой, ВД и КД и понять механизмы развития патологии растущей грудной клетки у детей.

Цель исследования — изучение качественных и количественных изменений хрящевых лакун и каналов в реберных хрящах у детей с ВД и КД по сравнению с реберными хрящами у детей с нормальной грудной клеткой.

Изучены фрагменты хрящей IV и V ребер от детей в трех исследуемых группах. В 1-й группе (контроль) изучали образцы хрящей IV и V ребер, полученные при аутопсиях 10 детей 8—17 лет обоих полов с нормальной грудной клеткой. Материал получен в Бюро судебно-медицинской экспертизы Москвы, за что приносим благодарность судебно-медицинскому эксперту Е.М. Кильдюшову. Во 2-ю группу вошли 12 пациентов 8—17 лет обоих полов с ВД, в 3-ю группу — 12 пациентов 9—17 лет обоих полов с К.Д. Материал от 2-й и 3-й групп больных получен при реконструктивной торакопластике в НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Москвы, за что приносим благодарность канд. мед. наук В.А. Плякину. В исследование не включены пациенты или умершие с травмами грудной клетки и с заболеваниями опорно-двигательного аппарата.

Мы учитывали, что хондроциты являются главными регуляторами структуры и метаболизма матрикса хрящей и за счет этого обеспечивают биомеханические свойства их матрикса [5]. Кроме того, трофику хряща обеспечивают хрящевые каналы с кровеносными и лимфатическими сосудами [4], поэтому проведено морфометрическое исследование хрящевых каналов и лакун, как содержащих, так и не содержащих хондроциты, у детей с нормальной грудной клеткой и у больных с ВД и КД.

Фрагменты тканей фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в Electrolytic decalcifying solution («Bio Optica», Италия). Образцы обезвоживали и заливали в парафиновые блоки с добавлением в парафин модификатора ГИСТОМИКС («БиоВитрум», Россия), после чего изготавливали серийные срезы толщиной 4—5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изучали и фотографировали препараты с помощью микроскопа LEICA DM4000 B LED с цифровой видеокамерой LEICA DFC7000 T и программным обеспечением LAS V4.8 («Leica Microsystems», Швейцария).

После гистологического изучения 68 поперечных срезов реберных хрящей провели их морфометрическое исследование (24 при ВД, 24 при КД, 20 в группе детей с нормальной грудной клеткой). Всю площадь препаратов фотографировали (объектив HC PL FLUOTAR 10×/0,30 PH1; площадь области снимка 1245×934 мкм, площадь фотографии 2 764 800 пикселей). Каждому изображению присваивали порядковый номер. В зависимости от размера образца реберного хряща на каждый микропрепарат формировали серию из 20—50 микрофотографий. Затем с помощью генератора случайных чисел (http://randstuff.ru/number/) из каждой серии отбирали по 10 микрофотографий. По каждой микрофотографии оценивали частоту встречаемости (в %) и среднюю относительную площадь хрящевых каналов по формуле (в мкм²) = a·10·0,42 мкм²/пиксель, где X — средняя относительная площадь хрящевых каналов в 10 полях зрения, а — сумма площади хрящевых каналов в 10 полях зрения (в пикселях), 0,42 мкм²/пиксель — геометрический коэффициент, используемый для перерасчета пикселей в мкм². Измерения проводили вручную при помощи инструментов Brightness/Contrast, Magneticlassotool программы Adobe Photoshop CS6. Расчет общего количества хрящевых лакун и пустых лакун (не содержащих хондроциты) осуществляли вручную с помощью инструмента CountTool с использованием формул: Y=(y1+y2+…+y10)/10, где Y – среднее количество лакун в 10 полях зрения, (y1+ y2+…+y10) – сумма всех лакун во всех 10 полях зрения; Z=(z1+z2+…+z10)/10Y, где Z — доля пустых лакун, (z1+ z2+…+z10) — сумма всех пустых лакун во всех 10 полях зрения, 1/10Y — коэффициент пересчета абсолютного числа всех пустых лакун в долях к общему числу лакун в 10 полях зрения. Для определения морфометрических критериев участков с большим и малым количеством хрящевых лакун (гипер- и гиполакунарных зон) в группе контроля проводили расчет границ 95% доверительного интервала (ДИ 95%) для среднего относительного числа количества лакун в 10 полях зрения. Таким образом, гипо- и гиперлакунарными зонами считали зоны, где в поле зрения количество всех хрящевых лакун было соответственно ниже нижней границы ДИ 95% и выше верхней границы. Полученные количественные критерии в дальнейшем использовали при расчете частоты встречаемости гипо- и гиперлакунарных зон как в группе контроля, так и во 2-й и 3-й группах. Первичную статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ IBM SPSS Statistics 20. Далее расчет границ ДИ 95% для частот встречаемости хрящевых каналов, гипо- и гиперцеллюлярных зон в исследуемых группах производили по формуле:

P±1,96·√(P·(1−P)N+0,5N) ·100 (в %),

где P — выборочная доля (в долях единицы), N — общее число наблюдений [6] — с помощью программы Excel стандартного пакета Microsoft Office 2010. Оценку различий средней относительной площади хрящевых каналов во всех трех группах осуществляли посредством сравнения ДИ 95% для средних значений. Далее с помощью программы Excel стандартного пакета Microsoft Office 2010 были построены столбиковые диаграммы. Для оценки корреляции между возрастом, средним количеством лакун, долей пустых лакун, средней относительной площадью хрящевых каналов в стандартном пакете программ IBM SPSS Statistics 20 применяли двусторонний критерий Спирмена при уровне значимости р=0,05.

В группе контроля реберный хрящ представлен гиалиновой хрящевой тканью, покрытой надхрящницей (рис. 1).

Статистическая обработка данных морфометрии не только подтверждает наличие вышеуказанных различий между группой контроля и группами с ВДГК, но и выявляет характерные морфометрические особенности реберных хрящей как у больных 2-й группы с ВД, так и у пациентов 3-й группы с КД с учетом их возраста (см. таблицу,

В группе контроля среднее количество лакун на площадь 1245×934 мкм составляет 198,64, нижняя граница 95% ДИ — 177,74, верхняя — 219,54. Таким образом, для всех трех групп поле зрения с количеством лакун менее 177 является гиполакунарной зоной, а более 220 — гиперлакунарной. Как общее количество хрящевых лакун, так и частота встречаемости гиперлакунарных зон наибольшие в группе контроля и наименьшие в 3-й группе у пациентов с КД; больные 2-й группы с ВД занимают промежуточное положение. Для гиполакунарных зон ситуация иная — наибольшая частота их встречаемости характерна для детей с КД (3-я группа), а наименьшая — для группы контроля.

В 3-й группе у больных с КД хрящевые каналы наблюдаются достоверно реже, чем у детей в группе контроля. При этом больные 2-й группы с ВД занимают промежуточное положение (см. рис. 4, д). Достоверные различия между площадью хрящевых каналов (см. рис. 4, е), а также достоверные корреляции между возрастом детей и площадью хрящевых каналов во всех исследуемых группах не обнаружены. Кроме того, только в группе контроля отмечались отрицательные корреляции между долей пустых лакун и средней относительной площадью хрящевых каналов: –0,796719 (p=0,000009), у пациентов обеих групп с ВДГК эти корреляции отсутствуют.

Анализ имеющейся литературы позволяет предположить, что при ВДГК у детей имеются структурно-функциональные изменения реберного хряща, что отражается на его способности к росту и адекватной перестройке скелета в ходе взросления [3]. В результате этих нарушений возникает деформация грудной клетки в виде либо ВД, либо К.Д. Однако патогенез этих изменений практически не известен и требует тщательной проверки.

Так, мы исследовали лакуны реберных хрящей, в которых располагаются хондроциты — клетки, определяющие структуру хряща [5]. Эти клетки получают питание из сосудов, расположенных в хрящевых каналах — производных надхрящницы, проникающих в хрящевую ткань и питающих всю ее толщу [4, 8]. Следовательно, метаболизм хряща (особенно глубоких отделов), а также его изменения в период роста грудной клетки у детей определяются в основном этими двумя структурами.

Наше исследование показало, что во всех реберных хрящах имеются зоны с высоким содержанием лакун хондроцитов (гиперлакунарные зоны) и с низким содержанием таких лакун — гиполакунарные зоны. Очевидно, в гиперлакунарных зонах интенсивность метаболических процессов выражена больше и не исключено, что рост хрящей с возрастом происходит именно за счет гиперцеллюлярных зон. В гиполакунарных зонах метаболизм менее интенсивен, кроме того, гиполакунарными зонами оказываются участки АТ «классического» и «переплетенного» типов со структурой, резко отличающейся от нативного матрикса реберного хряща [3, 7].

Проведенное морфометрическое исследование показало, что в норме общее количество хрящевых лакун достоверно больше, чем в группах с ВДКГ. Помимо уменьшения общего количества лакун, при ВДГК имеют место и различия в их распределении в хрящевой ткани: количество гиперлакунарных зон при ВД и КД достоверно меньше, а гиполакунарных достоверно больше, чем в норме. При этом хрящевых лакун особенно мало у пациентов, страдающих КД, хотя между ВД и КД нет достоверных различий. На это указывали и другие авторы, не использовавшие морфометрию [9], однако наши результаты противоречат данным морфометрии V. David и соавт. [10], согласно которым количество клеток и площадь хондроцитов в контроле и при ВД не различаются между собой. Однако наши объективные данные позволяют утверждать, что при деформациях грудной клетки у детей количество лакун и хондроцитов меньше, чем в нормальной хрящевой ткани, что, вероятно, приводит к нарушениям метаболизма хряща и роста ребер.

Кроме того, как в норме, так и при ВДГК в реберных хрящах имеются хондроциты с вакуолизированной цитоплазмой, апоптозными изменениями ядра и, наконец, пустые лакуны, не содержащие клеток. Не исключено, что эти изменения являются последовательными стадиями функционирования хондроцитов с последующей их гибелью и разрушением внутри лакуны в результате либо интенсивности их функций, либо нарушения питания. Известно, что при функционировании часть клеток постоянно подвергается апоптозу, а затем регенерирует, причем интенсивность их регенерации соответствует степени нагрузки на ткани или орган и обеспечивается соответствующей трофикой. Эти изменения в виде увеличения количества пустых лакун более характерны для больных с ВД, однако они не имеют статистической достоверности. При этом необходимо отметить, что кроме пустых лакун, возникших при гибели хондроцитов, возможно образование пустых лакун в связи со сжатием клеток при фиксации материала (при этом клетки внутри лакуны не попадают в срез). Возможно, в связи с этим мы получили статистически недостоверные различия между группами.

Нельзя исключить, что выявленные количественные изменения лакун могут быть связаны с нарушениями питания хряща. Морфометрическое изучение хрящевых каналов показало, что и количество этих каналов, и площадь наибольшие в норме. При ВДГК частота их встречаемости меньше, особенно при КД (статистически достоверно). Учитывая, что хрящевые каналы содержат кровеносные и лимфатические сосуды, можно полагать, что трофика хондроцитов у детей с деформациями грудной клетки хуже, чем при нормальном развитии реберных хрящей, что подтверждается данными корреляционного анализа: отрицательные корреляции между долей пустых лакун и площадью хрящевых каналов, наблюдаемые в норме, при ВДГК исчезают. Не исключено, что при ВД и КД трофическая функция хрящевых каналов ухудшается, поэтому их площадь перестает влиять на гибель хондроцитов в лакунах. Это, несомненно, должно сказываться на росте и функционировании хрящевой ткани передней стенки в растущей грудной клетке.

Выявленные нами стереотипные изменения реберных хрящей при ВД и КД не противоречат данным литературы [2]. Однако наши морфометрические исследования выявили определенные особенности этих изменений, которые характерны именно для ВД и КД, что позволяет говорить об этих изменениях как о различных проявлениях одного заболевания — дисплазии соединительной ткани в одном из ее видов — гиалиновом хряще. Однако для подтверждения этой гипотезы требуются генетические исследования.

Общее уменьшение количества хрящевых лакун с хондроцитами при ВДГК в связи с нарушением питания, очевидно, нарушает метаболизм экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) реберных хрящей. В этих условиях некоторое увеличение доли пустых лакун при ВД отражает гибель хондроцитов (возможно, в результате их гиперфункции), что еще больше угнетает метаболизм ЭЦМ. Кроме того, гибель всех хондроцитов в лакуне не позволяет осуществить фагоцитоз клеточного детрита сохранными клетками, как это происходит в норме при апоптозе, в связи с чем компоненты их цитоплазмы (включая ферменты, деградирующие ЭЦМ) беспрепятственно могут попадать в матрикс хряща. Все это, возможно, способствует снижению механической прочности реберных хрящей и западению передней грудной стенки.

При КД отмечаются наименьшее количество хрящевых лакун, а также наименьшая площадь и частота встречаемости хрящевых каналов. Поэтому можно утверждать, что метаболизм ЭЦМ при КД ниже, чем в норме и при В.Д. При этом только при КД выявляются отрицательные корреляции между долей пустых лакун и возрастом. Можно предположить, что снижение доли пустых лакун с возрастом связано с несоответствием объема лакун количеству хондроцитов (в более мелких лакунах большая вероятность обнаружить хондроциты). Гибель хондроцитов, о чем свидетельствует увеличение доли пустых лакун как при ВД, для КД не характерна, в связи с чем возможность попадания их ферментов в ЭЦМ с последующим его разрушением менее вероятна. Кроме того, нельзя исключить, что замедленный метаболизм не позволяет реберным хрящам адаптироваться к изменениям передней стенки грудной клетки при росте ребенка, что в совокупности с отсутствием разрушения хондроцитов в лакунах и приводит к ее протрузии вперед.

Выявленные нами изменения клеток и хрящевых каналов при ВД и КД, несомненно, сказываются на состоянии ЭЦМ реберных хрящей и изменении его механической прочности. Одним из наиболее вероятных механизмов, отражающих такие изменения ЭЦМ, на наш взгляд, являются нарушения процесса АТ матрикса реберных хрящей, характерные для ВДГК [3]. Вероятно, при ВДГК более выраженная АТ не только меняет механические свойства матрикса, но и приводит к уменьшению количества лакун за счет их разрушения [7] и таким образом формируется порочный круг, характерный для описанных патологических процессов.

1. В патогенезе ВД и КД у детей ведущую роль играют нарушения трофики реберных хрящей, обусловленные уменьшением в них количества хрящевых каналов с сосудами, и хрящевых лакун, что проявляется снижением числа гиперлакунарных и увеличением гиполакунарных зон.

2. Выявленные структурно-функциональные изменения носят в основном стереотипный характер и, вероятно, приводят к замедлению роста хрящей, а также к изменению их механических свойств, что нарушает адаптацию передней грудной стенки к механическим нагрузкам и росту грудной клетки ребенка, приводя к ВДГК.

3. При ВДГК имеются определенные морфологические особенности изменений реберных хрящей у детей, что обусловливает развитие ВД либо КД.

4. Наличие стереотипных морфологических изменений реберных хрящей при ВД и КД у детей указывает на то, что они являются разными проявлениями одного заболевания — дисплазии соединительной ткани.

5. Для определения причины ВДГК у детей, которой может быть дисплазия соединительной ткани больного, необходимы генетические исследования.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда по гранту № 14−25−00055.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.В.К., А.Б.Ш., В.С.П.

Сбор и обработка материала — А.В.К., А.Л.Ф.

Статистическая обработка — А.В.К.

Написание текста — А.В.К., А.Л.Ф.

Редактирование — А.Б.Ш., В.С.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Курков Александр Витальевич — https://orcid.org/0000-0002-6258-3067; e-mail:a-kurkov@yandex.ru