В качестве фактора, сдерживающего широкое применение биопротезов (БП) клапанов сердца, рассматривали их ограниченный срок службы, как правило, являющийся следствием развития кальцийассоциированных структурных дисфункций [1]. Современные подходы решения проблемы продления сроков функционирования БП реализуются в нескольких направлениях, включающих улучшение их конструктивных характеристик, оптимизацию методов предымплантационной обработки ксеногенных тканей [2], исследования потенциальных воздействий на темпы развития дистрофической кальцификации, а также молекулярно-клеточных механизмов, лежащих в ее основе [3, 4]. Однако, несмотря на прилагаемые усилия, значительного прогресса в данной области до сих пор не достигнуто [2].

На моделях атеросклеротического поражения сосудов и дегенеративного стеноза нативного аортального клапана показано, что кальцификация мягких тканей имеет много сходных черт с физиологическими процессами минерализации кости и представляет собой универсальный активный процесс, подверженный сложной регуляции [5, 6]. При этом существует предположение, что преимущественная активация тех или иных сигнальных путей, опосредующих инициацию и прогрессирование кальцийассоциированной деградации биологических структур, определяется широким спектром модулирующих факторов, к числу которых могут быть отнесены воспаление, механические воздействия, изменения ионного и клеточного состава микроокружения, а также соотношение промоутеров и ингибиторов, обеспечивающих баланс между образованием кальцинатов и их резорбцией [5, 7].

В экспериментальных исследованиях продемонстрирована способность гладких миоцитов сосудов подвергаться дифференцировке в остеобластоподобные клетки [6]. Сравнительно недавно получила признание другая точка зрения, в соответствии с которой источником клеток остеобластного фенотипа являются полипотентные стволовые клетки реципиента. Этот механизм патологической кальцификации подразумевает активное участие клеток-предшественников, способных под влиянием ряда специфических хемоаттрактантов устремляться в стенки поврежденных артерий и створки сердечных клапанов [8, 9]. Вероятно, подобные изменения могут иметь место и в ксеногенных тканях. О возможности экстраполяции представленных данных свидетельствуют результаты сравнительных ультраструктурных и физико-химических исследований нативных клапанов и эксплантированных БП [10, 11].

Ранее в серии наших работ, посвященных исследованию состава кальцинированных БП, извлеченных при реоперациях, продемонстрировано активное участие клеток реципиента в формировании деструктивных изменений ксеногенных тканей [12, 13]. Однако изучение эксплантированных клапанов в финальной стадии их минерализации не позволяет оценить динамику данного патологического процесса. Вместе с тем получение новых знаний о факторах инициации структурных изменений химически модифицированного биоматериала в организме реципиента будет способствовать не только пониманию механизмов первичной тканевой несостоятельности, но и разработке эффективных стратегий, направленных на продление сроков функционирования БП.

Целью настоящего исследования явилось изучение клеточного состава функционально сохранного ксеноперикардиального клапана после продолжительного периода имплантации реципиенту с приобретенным митральным пороком.

В работе исследован Б.П. Юнилайн («Неокор», Кемерово), извлеченный из митральной позиции при патологоанатомическом исследовании. Створки представленного ксеноклапана изготовлены из перикарда быка, в качестве консерванта использован раствор диглицидилового эфира этиленгликоля [2].

Взятие материала осуществлялось на базе патологоанатомического отделения ГАУЗ «Кемеровская областная клиническая больница», согласно разрешению Министерства здравоохранения и социального развития России (приказ № 596/76, рег. № 10330 от 11.09.07) и РАН (приказ № 223н/38 от 06.05.08). Срок функционирования БП в организме реципиента составил 7,2 года. Причиной летального исхода явилась полиорганная недостаточность, обусловленная нарушением гемодинамики вследствие дисфункции другого бескаркасного БП в аортальной позиции, и сопутствующая соматическая патология. Следует отметить, что при жизни пациента по данным эхокардиографических исследований структурных изменений митрального ксеноклапана выявлено не было, аналогичное заключение получено и при аутопсии.

Створки аналогичного интактного БП любезно предоставлены ЗАО «Неокор» (Кемерово).

Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследований эксплантированный БП целиком помещали на 48 ч в 4% раствор параформальдегида. После фиксации из створок вырезали фрагменты, которые подвергали декальцинации в 9% водном растворе ЭДТА с последующей стандартной гистологической проводкой с заливкой в парафиновую смесь Histomix («БиоВитрум», Россия). Из парафиновых блоков на полуавтоматическом микротоме (МЗП 01-Техном, Россия) готовили срезы толщиной 5 мкм. Срезы для ИГХ-исследования монтировали на предметные стекла с полилизиновым покрытием («Thermo Scientific», США).

Для ИГХ-типирования клеток применяли следующие маркеры: СD3 (Т-лимфоциты), СD20 (В-лимфоциты), СD31, СD34 и VEGFR2 (эндотелиоциты), СD68 (моноциты/макрофаги), виментин (фибробласты), α-гладкомышечный актин (гладкие миоциты). Использовали моноклональные мышиные (СD3, СD20, СD34, СD68, виментин) и кроличьи (СD31, α-гладкомышечный актин), а также поликлональные кроличьи (VEGFR2) антитела Novocastra Laboratories, Thermo Scientific и Spring Bioscience, реагирующие с антигенами человека.

Для выявления описанных выше маркеров проводили высокотемпературную демаскировку антигенов в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) — α-гладкомышечный актин, CD68, СD31, СD34, VEGFR2, СD3; в трис-ЭДТА-буфере (рН 9,0) — виментин; без демаскировки — СD20. Блокирование эндогенной пероксидазы, разведение первичных антител, и время их экспозиции определяли, согласно протоколам производителей первичных антител. Для обнаружения результатов ИГХ-реакции использовали полимерную визуализирующую систему Novolink (Polymer detection system)» («Novocastra», Англия). Иммуноферментную реакцию останавливали, промывая срезы в фосфатном буфере (рН 7,4), после чего докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Параллельно с выявлением антигенов при каждом окрашивании проводили постановку положительного и отрицательного контроля.

Часть материала БП заключали в смесь эпоксидных смол и изготавливали шлифы, которые изучали с применением световой и электронной микроскопии [14]. Створки Б.П. фиксировали в двух сменах 4% раствора параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (12 ч в каждом). Дегидратированные образцы заключали в эпон («Sigma-Aldrich», США). Полученные блоки шлифовали до необходимой глубины и полировали поверхность с использованием прибора TegraPol-11 («Struers», Дания). Далее проводили полихромное окрашивание поверхности срезов по методу Aparicio и Marsdend [15]: 1% раствором толуидинового синего на 1% растворе буры и 1% раствором основного фуксина. В результате этой процедуры ядра клеток окрашиваются в сине-фиолетовый, цитоплазма — в голубой, коллагеновые и эластические волокна — в ярко-красный и синий цвета соответственно. Структуру створок БП оценивали на микроскопе AXIO Imager A1 («Carl Zeiss», Германия).

Для ультраструктурного исследования образцы после шлифовки и полировки контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, напыляли углеродом и изучали методом сканирующей электронной микроскопии в отраженных и обратно-рассеянных электронах (Hitachi S 3400 N, Япония). Изображение, полученное в режиме обратно-рассеянных электронов, аналогично таковому при проведении просвечивающей электронной микроскопии, но имеет негативный контраст.

С целью корректной интерпретации изменений химически модифицированных тканей, происходящих в процессе длительного функционирования БП в организме реципиента, предварительно выполняли оценку аналогичного интактного ксеноклапана. На гистологических срезах створок ранее не имплантированного протеза наблюдали наличие трех слоев: двух внешних, расположенных на предсердной (приточной) и желудочковой (запирающей) поверхностях, и заключенный между ними центральный (внутренний).

Обращает на себя внимание полное отсутствие клеток в тканях исследуемых образцов (рис. 1). Створка интактного БП представлена исключительно межклеточным веществом соединительной ткани: волокнистым компонентом и основным аморфным веществом. Расположение волокон компактное, их тинкториальные свойства без особенностей. На внешних поверхностях створок отсутствует эндотелий. Кровеносных капилляров в структуре неимплантированного ксеноклапана не обнаружено, вместе с тем на предсердной и желудочковой поверхностях определяли отдельные субэндотелиально расположенные щелевидные пространства.

При светооптическом исследовании створок БП, полученного при аутопсии, также выявляли три зоны, имеющие гистологические различия: предсердную (приточную) и желудочковую (запирающую) поверхности, а также средний (внутренний) или центральный слой.

В средней зоне (рис. 2, а) створки ксеноклапана, извлеченного из митральной позиции реципиента, имели высокую сохранность структуры — компактное расположение, плотную упаковку и извитость волокон соединительной ткани без нарушения тинкториальных свойств. Наряду с этим в некоторых участках БП идентифицировали интерстициальный отек, разрыхление и разволокнение коллагена, а также полости, содержащие фрагменты разрушенных ксеногенов тканей. Коллагеновые волокна, непосредственно примыкающие к полостям, имели неравномерное окрашивание.

Желудочковая зона створки эксплантированного БП в большинстве исследуемых фрагментов представлена широким бесструктурным слоем глыбчатых и хлопьевидных масс, обладающих умеренной базофилией, содержащих разрушенные волокна межклеточного вещества соединительной ткани (см. рис. 2, б). На границе между описанными выше слоями определяли моноциты, макрофаги и гигантские многоядерные клетки. В отдельных областях запирающая поверхность БП имела нормальное строение, при этом клеточные элементы в прилежащих к ней участках отсутствовали.

Предсердная зона створки ксеноклапана по строению была аналогична желудочковой поверхности, однако отличалась более рыхлым расположением коллагеновых волокон (см. рис. 2, в). Нативных участков в ее структуре не определялось, а клеточный состав характеризовался большей выраженностью и разнообразием. Наряду с моноцитами и макрофагами обнаруживали нейтро- и эозинофильные лейкоциты.

Для изучения недекальцинированных БП на светооптическом уровне исследуемые образцы заключали в эпоксидную смолу с последующими шлифовкой и полировкой блоков, а также окрашиванием по методу Aparicio и Marsdend. При использовании данного подхода на некоторых участках желудочковой поверхности ксеностворок удалось обнаружить присутствие монослоя удлиненных веретеновидных клеток (рис. 3, а), которые при ИГХ-типировании были VEGFR2-позитивны, что позволило отнести их к эндотелиоцитам (см. рис. 3, б). Между эндотелиоцитами и подлежащими коллагеновыми волокнами, как правило, располагался бесструктурный слой, имеющий различную толщину, в котором отсутствовали клеточные элементы и волокна межклеточного вещества соединительной ткани. В отдельных образцах наблюдали наличие щелевидных пространств, имеющих сходство с капиллярами. Данные полости также выстланы эндотелием, в некоторых из них отмечали присутствие эритроцитов и других форменных элементов крови (рис. 4, а, б). Обращает на себя внимание, что при наличии эндотелиоцитов на поверхностях БП в участках створок, расположенных непосредственно под субэндотелиально лежащим бесструктурным слоем, клетки реципиента отсутствовали, а коллагеновые волокна имели плотную упаковку (см. рис. 3, а).

В некоторых областях желудочковой или предсердной поверхности БП эндотелий представлен единичными высокими клетками. Следует отметить, что в субэндотелиально расположенном бесструктурном слое этих образцов определяли большое количество щелевидных пространств, стенки которых также выстланы клетками VEGFR2+ (см. рис. 4).

В толще ксеностворок, в участках, непосредственно примыкающих к поверхностям, покрытым эндотелием, содержащим высокие клетки, среди волокон коллагена выявлены моноциты/макрофаги и клетки Пирогова—Лангханса (рис. 5, а, б). Отмечена прямая связь между протяженностью зон разволокнения/деструкции коллагеновых волокон и выраженностью скоплений описанных клеточных элементов. При ИГХ-исследовании данные клетки идентифицированы как CD68-позитивные (см. рис. 5, в).

Кроме эндотелиоцитов и макрофагов, в обоих внешних слоях БП обнаружены фибробласты и гладкие миоциты, которые располагались между коллагеновыми волокнами поодиночке или небольшими группами (рис. 6).

Для всех изученных типов клеток с предсердной поверхности створок наблюдали большую глубину их проникновения в структуру ксеногенного материала.

На внешних поверхностях створок БП с обеих сторон определяли участки, на которых эндотелий отсутствовал, при этом большая их протяженность была характерна для пути притока. При полном разрушении эндотелиального слоя отмечали наиболее грубую деструкцию волокон коллагена и значительное увеличение количества макрофагов. Обращало на себя внимание, что макрофаги располагались главным образом вдоль коллагеновых волокон, а выраженность мононуклеарной инфильтрации коррелировала со степенью дегенеративных изменений тканей Б.П. Фрагментация и гомогенизация коллагена сопровождались формированием полостей и появлением клеток Пирогова—Лангханса (см. рис. 5, а, б).

При ИГХ-идентификации гладких миоцитов и фибробластов отмечено их присутствие исключительно в поверхностных участках створок (см. рис. 6). При этом если в наружных слоях БП α-гладкомышечный актиниммунопозитивные клетки располагались в виде групп, то в более глубоких их плотность визуально меньше, а расположение одиночное (см. рис. 6, а). Виментинположительные клетки имели центрально-локализованное продолговатое ядро с преобладанием эухроматина и цитоплазматическое иммунное окрашивание (соответствующее локализации виментина), что позволило подтвердить их принадлежность к фибробластам (см. рис. 6, б). CD3-положительные (Т-лимфоциты) и CD20-положительные (В-лимфоциты) клетки в исследуемых образцах не обнаружены.

Отсутствие клеток в образцах интактного БП связано с особенностями изготовления, направленными на снижение иммуногенных свойств ксеногенного материала за счет его девитализации и децеллюляризации. Компактное расположение волокон без признаков деструкции в свою очередь свидетельствует о высокой сохранности соединительнотканных элементов створок, позволяющей обеспечить необходимые функциональные характеристики БП.

Однако исследование эксплантированного клапана позволило идентифицировать несколько типов клеток. Несмотря на то что ИГХ-типирование не позволяет установить видовую принадлежность клеточных элементов, обнаруженных в химически модифицированном ксеноматериале, факт их появления в структуре БП, а также морфологическая сохранность убедительно свидетельствуют о принадлежности реципиенту. Присутствие клеток преимущественно в поверхностных слоях створок и их расположение вдоль коллагеновых волокон подтверждают гипотезу о возможности проникновения полипотентных предшественников из кровотока с последующей дифференцировкой в различных направлениях, в том числе в остеогенном [12, 13].

Выявленная ассоциация между степенью дегенеративных изменений поверхности БП, с одной стороны, а также количеством и разнообразием идентифицируемых в составе створок клеток — с другой, на наш взгляд, является отражением пусковой роли нарушения целости поверхностного слоя в развитии структурных дисфункций имплантированных клапанов. Таким образом, можно предполагать инициирующий эффект данного процесса в фиксации циркулирующих стволовых клеток реципиента и дальнейшей репопуляции тканей БП.

В этом контексте особое внимание заслуживает присутствие в отдельных участках исследуемых образцов монослоя клеток, по морфологическим и иммуногистохимическим свойствам относящихся к эндотелиоцитам. Наличие эндотелиального слоя различной степени сохранности может рассматриваться как подтверждение того факта, что эндотелизация данного типа протезов является закономерным процессом. Источником формирования эндотелиального слоя у основания створок ксеноклапанов, вероятно, является эндокард, в то время как эндотелизация свободного края створок по всей видимости обусловлена проникновением циркулирующих в кровотоке малодифференцированных предшественников, относящихся к пулу стромальных стволовых клеток.

Обращает на себя внимание, что между химически модифицированным (в процессе консервации) коллагеном и эндотелием реципиента присутствовал бесструктурный материал. При этом выраженность субэндотелиально расположенного бесструктурного слоя в значительной степени варьировала в различных участках створок Б.П. Поскольку коллагеновые волокна в описываемом слое отсутствовали, участие фибробластов в его создании маловероятно. Не исключено, что он представлен отложениями фибрина, который после структурирования может выступать в качестве субстрата для адгезии и миграции циркулирующих клеток-предшественников [16]. Субэндотелиально расположенные щелевидные пространства на запирающей (желудочковой) поверхности створок, вероятно, являются следствием утолщения и разрыхления этого слоя в процессе длительного функционирования имплантированного клапана. Можно предполагать, что эндотелизация поверхностей этих пространств ведет к образованию капилляров. Наличие в их просвете форменных элементов крови свидетельствует о функциональной полноценности данных структур. На наш взгляд, нельзя исключить, что эти вновь образованные сосуды являются альтернативным путем доставки циркулирующих стромальных клеток, а также моноцитов и лейкоцитов в ткани БП.

Различная сохранность эндотелиального и субэндотелиального слоев, коррелирующая со степенью деструктивных изменений подлежащих тканей и выраженностью клеточной инфильтрации во внешних участках БП, позволяет предполагать, что данные изменения представляют собой последовательные стадии патологического процесса, развивающегося в ксеноклапане и приводящего к его деградации. Вероятно, на начальном этапе эндотелиоциты и тонкий субэндотелиально расположенный слой выполняют барьерную роль, изолируя и защищая материал БП от проникновения циркулирующих в кровотоке клеток воспаления и клеток-предшественников остеогенного и фибробластического дифферонов. В последующем по мере функционирования имплантированного клапана происходит деградация эндотелиального слоя. В качестве факторов, способствующих этому процессу, могут выступать циклические деформации створок в организме реципиента и меняющиеся гидродинамические характеристики потоков крови. В условиях продолжительных гемодинамических нагрузок происходит дальнейшая деструкция створок с последующей утратой защитных свойств эндотелиального слоя, следствием чего являются миграция клеток реципиента, репопуляция и неоваскуляризация тканей БП.

Кроме эндотелиоцитов среди клеток, заселяющих створки БП, идентифицированы макрофаги. Деструкция, фрагментация и гомогенизация тканей ксеноклапана, а также формирование полостей свидетельствуют о высокой коллагенолитической способности этих клеток. Продукты распада коллагена, являясь хемоаттрактантами для моноцитов, в свою очередь усиливают их миграцию из сосудистого русла и поддерживают локальный воспалительный процесс. Также известно, что при деградации коллагена изменяется его аффинность к ионам кальция, содержащегося в сыворотке крови, что может играть триггерную роль в образовании кристаллов гидроксиапатита и способствовать минерализации БП [17]. Отсутствие CD3-положительных (Т-лимфоциты) и CD20-положительных (В-лимфоциты) клеток указывает на слабую выраженность иммуновоспалительных реакций реципиента, являющуюся следствием высокой иммунологической резистентности ксеноперикарда, консервированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля.

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что эндотелиоциты на поверхности БП выполняют защитную функцию, изолируя внутренние слои материала створки от агрессивного воздействия клеток реципиента. Кроме того, процесс эндотелизации увеличивает тромборезистентность БП и снижает иммуногенность ксеногенных тканей. При утрате барьерной роли эндотелиального слоя происходит клеточно-опосредованная деградация имплантированного клапана. Дальнейшие сценарии развития патологического процесса могут зависеть от преимущественной активации остеогенных или фибробластических клеточных линий, определяемых индивидуальными особенностями реципиента, а также системными и местными регулирующими влияниями. Логическим завершением описанных процессов является развитие того или иного варианта структурных дисфункций БП — кальциевой дегенерации или первичной тканевой несостоятельности без минерализации. Кроме того, на наш взгляд, нельзя недооценивать факт снижения бактериальной устойчивости ксеногенного материала при развитии начальных стадий деструктивных изменений поверхностей створок БП, что является одним из предрасполагающих факторов инфицирования и развития протезного эндокардита.

С позиций создания новых моделей биологических клапанов сердца необходимо учитывать постоянный контакт химически модифицированного ксеногенного материала с кровью пациента [18]. Идеальным вариантом для изготовления БП может быть полностью децеллюляризированная ткань, пригодная для заселения собственными клетками реципиента. Однако производство таких клапанов связано с большими методическими трудностями, прежде всего обусловленными невозможностью обеспечения адекватного кровоснабжения данных конструкций [19, 20]. В случае имплантации подобных БП трудно ожидать топографически адекватной его ревитализации, синхронизированной с образованием неокапилляров.

Другим приемлемым вариантом усовершенствования существующих моделей протезов является создание максимально благоприятных условий для эндотелизации створок [21, 22]. Наличие эндотелия на поверхности ксеноклапана будет способствовать дополнительной его изоляции и препятствовать колонизации клетками реципиента, а также снижать иммуногенность и вероятность активации воспалительных процессов [23].

Таким образом, эндотелизация створок БП является дополнительным фактором, обеспечивающим сохранность имплантированного клапана в агрессивной для него среде. Ввиду вышесказанного представляют интерес исследования, направленные на модификацию поверхностей створок БП и оптимизацию условий прикрепления и функционирования предшественников эндотелиоцитов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.