Кирюхин С.О.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН; Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Макарова О.В.

Государственная новосибирская областная клиническая больница

Морфологические изменения мышечной оболочки и интерстициальных клеток Кахаля ободочной кишки при экспериментальном язвенном колите

Журнал: Архив патологии. 2016;78(5): 27-32

Просмотров : 111

Загрузок : 5

Как цитировать

Кирюхин С. О., Макарова О. В. Морфологические изменения мышечной оболочки и интерстициальных клеток Кахаля ободочной кишки при экспериментальном язвенном колите. Архив патологии. 2016;78(5):27-32. https://doi.org/10.17116/patol201678527-32

Авторы:

Кирюхин С.О.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН; Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Все авторы (2)

Интерстициальные клетки Кахаля (ИКК) впервые описаны испанским нейроморфологом Сантьяго Рамон-и-Кахалем в 1893 г. Это отростчатые клетки, формирующие сложные трехмерные сети в стенке полых органов желудочно-кишечного тракта [1], репродуктивной [2] и мочевыделительной систем [2, 3]. В русскоязычной литературе часто используется аббревиатура ИКК (интерстициальные клетки Кахаля), соответствующая англоязычной ICC (Interstitial Cells of Cajal). Клетки Кахаля развиваются из кишечной мезенхимы и имеют общий с гладкими миоцитами предшественник [1]. ИКК характеризуются веретеновидной или звездчатой формой с 2-7 длинными ветвящимися отростками. Важной особенностью ИКК является их колокализация с нервной и гладкомышечной тканью. В органах желудочно-кишечного тракта отростки клеток Кахаля соединяются между собой и с лейомиоцитами посредством щелевых контактов [1], а с энтеральной нервной системой - через синаптоподобные контакты [1].

Для выявления ИКК в гладкой мускулатуре используют иммуногистохимическую реакцию к специфическому маркеру тирозинкиназе c-Kit [4]. В мышечной оболочке кишки выделяют несколько субпопуляций клеток Кахаля: межмышечную, внутримышечную и подслизистую. ИКК межмышечной популяции локализованы в области миентерального нервного сплетения, и в толстой кишке они выполняют функцию водителей ритма [5]. Клетки внутримышечной популяции располагаются в толще продольного и кольцевого слоев мышечной оболочки. По ультраструктурной характеристике они подобны лейомиоцитам и участвуют в передаче медленных волн мембранного потенциала с клеток-пейсмекеров на гладкие миоциты. Клетки Кахаля подслизистой популяции располагаются в соединительной ткани подслизистой основы. Они аналогичны ИКК межмышечной популяции и в некоторых отделах кишечника могут выполнять функцию пейсмекеров [5].

В литературе клетки Кахаля у животных и человека подробно описаны в норме при физиологических условиях. Сведения о морфологических изменениях ИКК при неопухолевых и воспалительных заболеваниях кишечника ограничиваются небольшим числом работ [6]. Одним из наиболее тяжелых и относительно широко распространенных хронических воспалительных заболеваний кишечника у человека является язвенный колит (ЯК). В механизмах развития ЯК наряду с воспалительным процессом и нарушением слизисто-эпителиального барьера большую роль играет изменение моторной функции толстой кишки, в реализации которой принимают участие ИКК. Данные об изменениях клеток Кахаля у больных ЯК фрагментарны и противоречивы, что связано с трудностью получения клинического материала. Поэтому для изучения патологических механизмов ЯК используются экспериментальные модели, и среди них модель ЯК, индуцированного декстрансульфатом натрия (ДСН).

Цель работы - изучение морфологических изменений мышечной оболочки и межмышечной популяции ИКК при остром ЯК, индуцированном ДСН.

Материал и методы

Исследование проводили на 12 половозрелых самцах мышей линии C57Bl/6 массой тела 18-22 г (питомник «Столбовая»). Экспериментальный острый ЯК моделировали по I. Okayasu и соавт. [7] заменой питьевой воды на водный раствор ДСН. Животные опытной группы (n=6) получали 3% водный раствор ДСН (Mм 40 кДа, «BioChemica») в течение 5 сут, контрольная группа (n=6) - питьевую воду. Животных выводили из эксперимента на 7-е сутки цервикальной дислокацией под эфирным наркозом. Работу с экспериментальными животными проводили в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБНУ «НИИ морфологии человека».

Для морфологического исследования извлекали дистальный отдел ободочной кишки, разрезали его вдоль брыжейки, расправляли на милипоровом фильтре и фиксировали в жидкости Буэна в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем ткань обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и ксилоле, заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Маллори.

Для оценки изменений популяции ИКК использовали метод иммунофлюоресцентного окрашивания тотальных препаратов антителами к c-Kit [4]. Для этого иссекали фрагмент дистального отдела ободочной кишки размером 2-3 мм, фиксировали его в ацетоне в течение 2 ч при 4 °C. Образцы сохраняли в свежей порции фиксатора при –20 °С в течение не более 3 сут. Затем фрагмент ободочной кишки отмывали в 3 порциях PBS (pH 7,2) в течение 15 мин при комнатной температуре, разрезали вдоль брыжейки и механическим путем удаляли слизистую оболочку. Для визуализации клеток Кахаля использовали первичные моноклональные крысиные антитела к c-Kit (клон ACK4, «Abcam», ab112177) и вторичные антитела Alexa Fluor 594 («Life Technologies», A-11007). Все растворы антител готовили на блокирующем буфере (5% козья сыворотка, 0,2% Tween на PBS; pH 7,2) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Инкубацию образцов с первичными антителами проводили при постоянном перемешивании в течение 1,5 ч при 37 °C, со вторичными - при постоянном перемешивании в течение 1 ч при 37 °C. Для каждой группы образцов проводили соответствующие контроли. После проведения реакции образцы мышечной оболочки расправляли на предметном стекле и заключали в монтирующую среду, содержащую DAPI (ProLong Gold, «Life Technologies», P36935).

Препараты исследовали на флюоресцентном микроскопе Leica DM2000. Для каждого образца делали цифровые фотографии 3 случайных полей (ув. 200 для оценки плотности сети клеток, ув. 400 для оценки числа клеток). На микрофотографиях подсчитывали число c-Kit-положительных клеток в области межмышечного сплетения. Для оценки плотности сети клеток Кахаля межмышечной популяции применяли гистометрический метод точечного счета.

Статистическую обработку проводили в пакете Statistica 8 с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

При гистологическом исследовании дистальной части ободочной кишки мышей, получавших 3% водный раствор ДСН, был выявлен острый эрозивно-язвенный колит (рис. 1). Максимально выраженные патоморфологические изменения характеризовались замещением слизистой оболочки в зоне язв грануляционной тканью. В собственной пластинке слизистой оболочки наблюдались выраженный отек и воспалительная инфильтрация из лимфоцитов, нейтрофилов и гистиоцитов. В подслизистой основе отмечались резко выраженный отек, полнокровие кровеносных и расширение просвета лимфатических сосудов, выраженная воспалительная инфильтрация.

Рис. 1. Гистологический срез дистального отдела ободочной кишки мышей контрольной группы (а) и мышей, получавших 3% ДСН в течение 5 сут (б). При остром язвенном колите отмечается замещение слизистой оболочки грануляционной тканью, отек и воспалительная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. Мышечная оболочка расширена, в прослойках соединительной ткани выявляется воспалительный инфильтрат. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Мышечная оболочка представлена двумя слоями - циркулярным и продольным, толщина мышечной оболочки на поперечном срезе была увеличена по сравнению с контролем (см. рис. 1). Причиной этого может являться эндотоксинемия - повышение уровня эндотоксинов, и в частности липополисахарида E. coli (ЛПС), в крови. По данным С.О. Абдулаевой и соавт., при ДСН-индуцированном ЯК в сыворотке крови значительно повышается уровень эндотоксина [8]. Показано, что при действии ЛПС в системах in vitro [9] и in vivo [10] уменьшается длина гладких миоцитов и снижается их способность к сокращению под действием ацетилхолина.

В циркулярном слое мышечной оболочки картина мозаична: встречались зоны с отсутствием патологических изменений, но преобладали зоны гладкомышечных клеток, в цитоплазме которых выявлялись вакуоли (рис. 2). При окраске гематоксилином и эозином в них выявлялись гранулярно-фибриллярные эозинофильные массы, слабо окрашенные ядра с нечеткими границами. В соединительной ткани между гладкими миоцитами выявлялись фибробластоподобные клетки и сосуды микроциркуляторного русла. Единичные в препарате диффузно-рассеянные лимфоциты и гистиоциты выявлялись в зонах, прилегающих к подслизистому слою. Между поперечным и продольным слоями лейомиоцитов располагались ганглии межмышечного сплетения. Сосуды микроциркуляторного русла в области нервного сплетения неравномерно расширены. Изменений в структуре ганглиев и в продольном слое гладких миоцитов по сравнению с контролем не было выявлено. Выявленные при ДСН-индуцированном ЯК альтеративные изменения лейомиоцитов могут быть обусловлены эндотоксинемией. При связывании ЛПС с мембранными рецепторами TLR4 (toll-like receptor 4) активируются сигнальные пути, приводящие, с одной стороны, к повышению продукции активных форм кислорода, с другой - к активации транскрипционного фактора NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells). Активация NF-kB изменяет экспрессию ряда генов, определяющих функционирование лейомиоцитов, например кальциевых каналов L-типа и протеинкиназы C [10]. Повышение продукции активной формы кислорода может оказывать повреждающее действие на гладкие миоциты, а также способствовать изменению фенотипа гладкомышечных клеток с сократительного на синтетический по аналогии с сосудистыми гладкомышечными клетками [11].

Рис. 2. Мышечная оболочка ободочной кишки мышей контрольной группы (а-г) и мышей, получавших 3% раствор ДСН в течение 5 сут (д-з). В поверхностных слоях циркулярного слоя мышечной оболочки (д, е) выявляются вакуолизация цитоплазмы лейомиоцитов, расширение слоя межклеточного вещества, а в более глубоких слоях (ж, з) - группы лейомиоцитов со слабо окрашенной, фибриллярно-гранулярной цитоплазмой. а, в, д, ж - окраска гематоксилином и эозином, ×1600; б, г, е, з - окраска по методу Маллори, ×1600.

При иммунофлюоресцентном исследовании ободочной кишки у мышей опытной и контрольной групп вдоль волокон и вокруг ганглиев миентерального нервного сплетения выявлены небольшие c-Kit-положительные клетки с 2-6 длинными ветвящимися отростками (рис. 3). У мышей контрольной группы они образовывали плотную мелкоячеистую сеть. У мышей, получавших ДСН, плотность сети ИКК снижена (рис. 4, а). Изменения в численности клеток Кахаля в межмышечном сплетении мышей контрольной и опытной групп статистически незначимы (см. рис. 4, б). При исследовании препаратов отмечалось общее снижение интенсивности флюоресценции и изменение морфологии ИКК. Отростки клеток истончены, снижалось их ветвление, в цитоплазме части клеток выявлялись крупные (от 1 до 5 мкм) c-Kit-положительные гранулы (см. рис. 3).

Рис. 3. Тотальные препараты мышечной оболочки ободочной кишки мышей контрольной группы (а) и мышей, получавших 3% раствор ДСН в течение 5 сут (б). Плотность сети ИКК-МС у мышей опытной группы снижена, в теле клеток Кахаля наблюдается c-Kit-положительная гранулярность (б, вставка). Иммунофлюоресцентное окрашивание антителами к c-Kit, Alexa Fluor 488. а - ×200, б - ×1000 (вставка).

Рис. 4. Число клеток Кахаля (а) и объемная плотность сети ИКК-МС (б) дистального отдела ободочной кишки у мышей контрольной группы и при остром язвенном колите. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (Me (0,25; 0,75)). * - статистически значимые изменения (критерий Манна-Уитни; р<0,05) по сравнению с контрольной группой.

В опубликованной литературе отсутствуют данные о повреждении ИКК при ДСН-индуцированном колите у мышей. Однако выявленные нами изменения, очевидно, являются стереотипными, так как они обнаружены в других модельных системах и при патологии у человека. Для поддержания функционального состояния клеток Кахаля необходима достаточная активация c-Kit-сигнального пути фактором стволовых клеток (stem cells factor, SCF). Снижение числа клеток и длины отростков выявлено в тонкой кишке у морских свинок при введении специфического блокатора тирозинкиназ Imatinib mesylate (коммерческий препарат Glivec) [12]. Авторы предполагают, что блокада сигнального пути тирозинкиназы c-Kit приводит к так называемой трансдифференцировке клеток Кахаля, в ходе которой они приобретают черты лейомиоцитов. Блокада SCF-c-Kit-пути может происходить также из-за недостаточного количества лиганда. На модели диабетического гастропареза у мышей линии Balb/C уменьшение числа и удельной плотности клеток Кахаля является следствием снижения уровня SCF в гладкой мускулатуре желудка [13]. Аналогичные результаты получены и при использовании блокирующих антител к растворимой и мембранно-связанной изоформе SCF в органотипической культуре [13]. Авторы полагают, что причиной снижения уровня SCF является альтерация лейомиоцитов мышечной оболочки желудка.

Заключение

Таким образом, при остром язвенном колите у мышей изменения в мышечной оболочке ободочной кишки характеризуются ее утолщением, вакуольными изменениями лейомиоцитов, уменьшением относительной плотности сети клеток Кахаля межмышечной популяции с изменением их морфологии. Описанные изменения интерстициальных клеток Кахаля и гладких миоцитов могут являться следствием эндотоксинемии, ишемии и воздействия провоспалительных цитокинов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.О.К., О.В.М.

Сбор и обработка материала: С.О.К.

Статистическая обработка: С.О.К.

Написание текста: С.О.К.

Редактирование: О.В.М.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail