Хейнштейн В.А.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург; ГБУЗ «Клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)», Санкт-Петербург

Иевлева А.Г.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург

Имянитов Е.Н.

НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург

Шелехова К.В.

ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи», Санкт-Петербург, Россия; ЧОУВО «Санкт-Петербургский медико-социальный институт», Санкт-Петербург, Россия

Иммуногистохимический и генетический профиль меланом с веретеноклеточной морфологией

Журнал: Архив патологии. 2015;77(4): 17-23

Просмотров : 16

Загрузок : 1

Как цитировать

Хейнштейн В. А., Иевлева А. Г., Имянитов Е. Н., Шелехова К. В. Иммуногистохимический и генетический профиль меланом с веретеноклеточной морфологией. Архив патологии. 2015;77(4):17-23. https://doi.org/10.17116/patol201577417-23

Авторы:

Хейнштейн В.А.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург; ГБУЗ «Клинический научно-практический центр специализированных видов медицинской помощи (онкологический)», Санкт-Петербург

Все авторы (4)

Меланомы с преобладающей веретеноклеточной морфологией сравнительно редки и представляют собой гетерогенный клинико-морфологический спектр злокачественных опухолей с меланоцитарной дифференцировкой. Доминирующая веретеноклеточность может быть особенностью ряда нозологических подвариантов меланомы, таких как поверхностно распространяющаяся, нодулярная, лентигинозная, а также диагностическим признаком других, в частности десмопластических форм. Кроме этого, в литературе описаны так называемые «веретеноклеточные меланомы», которые одни авторы рассматривают в качестве отдельной нозологии, что создает определенную понятийную путаницу [1], а другие исследователи используют данный термин лишь как описательный [2].

Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование иммуногистохимического профиля спектра веретеноклеточных меланом на предмет его однородности и анализ мутаций в генах BRAF и NRAS.

Материал и методы

Для поиска веретеноклеточных меланом были пересмотрены меланомы и веретеноклеточные опухоли кожи архива НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова за 1982—2014 гг. и Санкт-Петербургского клинического научно-практического (онкологического) центра за 2012—2014 гг. Критериями отбора были дермальная/эпидермодермальная пролиферация атипичных веретеновидных клеток (не менее 80%) и доказательство меланоцитарной дифференцировки (наличие типичной интраэпидермальной меланоцитарной опухоли и/или иммуногистохимические маркеры меланоцитарного генеза). Было выявлено 58 случаев, строго отвечающих вышеуказанным критериям. В каждой опухоли были оценены следующие признаки: силуэт опухоли, симметричность, гистологическая архитектура, наличие юнкционального компонента, изъязвление эпидермиса, наличие пигмента, уровень инвазии по Кларку, толщина по Бреслоу, размер клеток и ядер, особенности их формы, выраженность атипии, митотическая активность с учетом феномена созревания, тип, выраженность коллагенизации стромы, ее качественный состав, наличие воспалительного инфильтрата, его качественный состав и внутриопухолевое распределение, наличие периневральной и васкулярной инвазии, а также сопутствующие изменения эпидермиса и дермы.

Для выяснения катамнеза были проанализированы истории болезни, медицинские карты наблюдения пациентов и данные телефонного опроса пациентов и/или родственников.

По результатам клинико-морфологического анализа с учетом отдаленных результатов спектр веретеноклеточных меланом был разделен на 6 групп:

А — нодулярные веретеноклеточные (полиповидное образование, как правило, пигментированное, с преобладающей фазой «вертикального» роста, компактной узловой пролиферацией опухолевых клеток и минимальным вовлечением эпидермиса; в 30% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 33 мес) (рис. 1, а);

Рис. 1. Разновидности меланом с веретеноклеточной морфологией. а — нодулярная веретеноклеточная меланома; б — поверхностно распространяющаяся, преимущественно веретеноклеточная, меланома; в — комбинированная веретеноклеточная меланома, сочетающая поверхностно распространяющуюся и саркоматоидную; г — саркоматоидный вариант; д — смешанная десмопластическая меланома: гнезда эпителиоидных клеток расположены среди полей десмопластической меланомы; е — чистый десмопластический вариант. Окраска гематоксилином и эозином. а, б, г—е — ×50, в — ×20.

Б — поверхностно распространяющиеся веретеноклеточные (пигментированное пятно или плоская бляшка с четкими контурами, гистологически выраженная «радиальная» фаза роста; в 14% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 120 мес) (см. рис. 1, б);

В — комбинированные (макроскопически сходные с нодулярной либо поверхностно распространяющейся меланомой, но микроскопически сочетающие один из вышеуказанных вариантов с десмопластической формой; в 50% — метастазы в регионарных лимфатических узлах, безрецидивная выживаемость — 12 мес) (см. рис. 1, в);

Г — саркоматоидные (плоская бляшка светло-серого или белесоватого цвета, без четких контуров с окружающими тканями, диффузно-компактная дермальная пучковая веретеноклеточная пролиферация с межпучковым типом коллагенизации, отчетливо визуализируемым при окраске по Массону; в 25% — местный рецидив, безрецидивная выживаемость — 18 мес) (см. рис. 1, г);

Д — смешанные десмопластические (беспигментное уплотнение кожи или плоская плохо очерченная бляшка, микроскопически сочетание десмопластической формы с участками саркоматоидной и/или эпителиоидноклеточной популяции; в 43% — местные рецидивы, безрецидивная выживаемость — 9,3 мес) (см. рис. 1, д);

Е — чистые десмопластические (беспигментное уплотнение кожи, напоминающее рубец, при гистологическом исследовании гипоклеточная диффузно-инфильтративная дермально-субдермальная пролиферация с межклеточным типом коллагенизации, составляющая 90% и более; в 75% — местные рецидивы, безрецидивная выживаемость — 8,6 мес) (см. рис. 1, е).

Морфологический анализ проводился по микропрепаратам, окрашенным гематоксилином и эозином, трихромом по Массону, по Вейгерту на эластические волокна, ШИК-реактивом, импрегнированных серебром для визуализации ретикулиновых волокон. Иммуногистохимическое исследование выполнено на автостейнере Ventana BM XT с использованием следующих антител: S100 («Genemed», Poly, 1:200), MelanA («Genemed», A103, 1:100), Melanosome («Genemed», HMB45, 1:100), Melanoma associated antigen («Ventana», PNL2, RTU), Melanoma associated antigen («Ventana», KBA.62, RTU), SOX10 («Cell Marque», Poly, 1:50), SMA («Cell Marque», 1A4, 1:200), CyclinD1 («Cell Marque», SP4, RTU), EMA («Cell Marque», E29, 1:100), Claudin1 («BOX Spring», Poly, 1:100), MITF («Cell Marque», C5/D5, 1:300), Collagen IV («DCS Innovative Diagnostic System», CIV22, 1:100), BRAF («BOX Spring», VE1, 1:100), c-Kit («Genemed», CD117, 1:100), DOG1 («Ventana», SP31, RTU), Nestin («Cell Marque», 10C2, 1:100). Количество опухолевых клеток, экспрессирующих антиген, оценивали полуколичественно: 0 — нет окрашивания, 1+ — окрашивание <5% клеток, 2+ — окрашивание 5—25% опухолевых клеток, 3+ — окрашивание 26—50% клеток, 4+ — окрашивание >50% клеток.

Участки парафиновых срезов опухоли выделялись для молекулярно-генетического анализа генов BRAF и NRAS, проводимого посредством ПЦР и секвенирования ДНК.

Результаты и обсуждение

В нашем исследовании все опухоли исследуемого спектра экспрессировали S100, SOX10, KBA.62 и нестин, что указывало на общность их генеза и подтверждало меланоцитарную дифференцировку. Была отмечена диффузная и выраженная коэкспрессия SOX10 (рис. 2, а), S100 и нестина. В большинстве исследованных случаев окрашивание KBA.62 выявлялось в 50% и более опухолевых клеток (см. рис. 2, б), за исключением 1 десмопластической меланомы, где экспрессия составила менее 5%, и 1 нодулярной с умеренно выраженной реакцией с 26—50% опухоли.

Рис. 2. Иммуногистохимический профиль веретеноклеточных меланом. а — ядерная экспрессия SOX10 в нодулярной веретеноклеточной меланоме. ×200; б — мембранно-цитоплазматическое окрашивание KBA.62 в меланоме саркоматоидного типа. ×200; в — иммуногистохимическая гетерогенность в комбинированной меланоме, сочетающей эпителиоидно-веретеноклеточную поверхностно распространяющуюся форму (MelanA-позитивен) с десмопластической (MelanA-негативен). ×60; г — ядерная экспрессия Cyclin D1 в чистой десмопластической меланоме. ×100; д — двойное окрашивание S100 (красная метка) и SMA (коричневое цитоплазматическое окрашивание) выявляет две разные популяции клеток в десмопластической меланоме. ×200; е — иммуноэкспрессия BRAF в веретеноклеточной нодулярной меланоме, имеющей одноименную мутацию. ×50.

Белки S100 и SOX10 являются также пан-шванновскими маркерами. Белок SOX10, кодируемый геном SOX10, локализующийся на 22-й хромосоме (22q13.1) и являющийся транскрипционным фактором, играет важную роль в формировании тканей и органов в процессе эмбриогенеза, особенно структур нервного гребня, периферической нервной и меланоцитарной системы, а также в поддержании уже дифференцированных клеток. Его роль в данном процессе делает этот транскрипционный фактор идеальным маркером шванновской и меланоцитарной дифференцировки клеток на различных стадиях их созревания. Исследованиями последних лет показано, что SOX10 является более специфичным и чувствительным маркером меланоцитарной и шванновской дифференцировки по сравнению с S100 [3]. KBA.62 — моноклональное антитело к антигенам, ассоциированным с меланомой, полученное с помощью специфической линии меланомных клеток. По данным разных авторов, иммунореактивность этого антитела составляет от 93 до 86% в различных вариантах злокачественной меланомы, в том числе 82% в десмопластическом типе [4, 5].

Белок нестин является одним из промежуточных филаментов и считается маркером нейроэктодермальных стволовых клеток, так как значительно экспрессируется в пролиферирующих клетках во время эмбрионального развития центральной нервной системы. В работе S. Brychtova и соавт. [6] экспрессия нестина была выявлена в доброкачественных меланоцитарных образованиях и в 84% первичных меланом. Причем увеличение количества нестин-позитивных клеток наблюдалось в поздних стадиях развития опухоли и соотносилось с более агрессивным течением заболевания. Результаты нашего исследования продемонстрировали выраженную экспрессию нестина в HMB45-негативных опухолях, отнесенных к смешанному и чистому десмопластическому варианту, что совпадает с данными работы M. Kanoh и соавт.[7], считающими нестин одним из основных диагностических маркеров НМВ45-отрицательных меланом. В нашей серии HMB45-позитивные опухоли также экспрессировали нестин, что противоречит данным M. Kanoh.

Неоднородность спектра на иммуногистохимическом уровне подчеркивала иммунореактивность с MelanA, HMB45 и PNL2, коррелировавших друг с другом. Если в группах веретеновидных меланом, классифицированных как поверхностно распространяющаяся и нодулярная, реакция с этими антителами была выраженная и составляла 50% и более, то в десмопластическом типе она отсутствовала (см. рис. 2, в). Эти результаты совпадают с данными других авторов [8]. При этом в группе, обозначенной нами как саркоматоидные и занявшей промежуточную позицию спектра, диффузно визуализировались отдельные клетки, экспрессировавшие вышеуказанные маркеры. Вероятно, это явление отражает различные уровни меланоцитарной дифференцировки клеток (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ иммунофенотипа меланом веретеноклеточного спектра Примечание. Здесь и в табл. 2: НВМ — нодулярная веретеноклеточная меланома, ПРВМ — поверхностно распространяющаяся веретеноклеточная меланома, КМ — комбинированная меланома, СМ — саркоматоидная меланома, СДМ — смешанная десмопластическая меланома, ЧДМ — чистая десмопластическая меланома.

В нашей серии была выявлена выраженная диффузная экспрессия циклина Д1 во всех исследованных опухолях, в том числе в чистых, смешанных десмопластических меланомах и так называемых саркоматоидных (см. рис. 2, г). Циклин Д1 играет важную роль в процессах клеточной пролиферации, в прогрессии от G1 к S-фазе и является онкогеном в меланомах [9]. Несмотря на уже общеизвестный факт об иммуногистохимической гиперэкспрессии этого маркера в большинстве меланом, мы не встретили работ, изучавших экспрессию циклина Д1 в десмопластических вариантах.

Среди меланом веретеноклеточного спектра нами было выявлено 36% CD117-позитивных случаев, при этом иммунореактивность с DOG1 отсутствовала. Экспрессия CD117 документирована в меланомах, преимущественно акральной локализации. Среди веретеноклеточных вариантов D. Miller и соавт. [10, 11] отметили существенную разницу между чистыми и смешанными десмопластическими меланомами. Они обнаружили 26% CD117-позитивных чистых десмопластических меланом и 78% позитивных смешанных, при этом не было строгой корреляции с наличием мутаций в гене c-kit (экзоны 11, 13 и 17). Данный факт авторы объясняют либо незрелостью белка, продукта данного гена, либо возможными мутациями других экзонов.

В настоящей серии меланом с веретеноклеточной морфологией мы не выявили популяции клеток с периневральной дифференцировкой (ЕМА и Сlaudin1 были негативные во всех исследованных случаях), которая иногда встречается в невусах [12].

Во всех группах, за исключением комбинированных меланом, отмечалась внутриопухолевая однородность иммунофенотипа. В группе комбинированных меланом обращала на себя внимание бифазность. Опухоли сочетали дифференцированные участки веретеноклеточной нодулярной или поверхностно распространяющейся меланомы с десмопластическим или саркоматоидным типом. При этом иммунофенотип их различался в пределах одной опухоли (см. рис. 2, в).

Интересной особенностью, отмеченной и в предыдущих работах, явилась диффузная иммуноэкспрессия SMA в меланомах десмопластического типа [13]. При этом двойное окрашивание с S100 показало, что гладкомышечный актин экспрессируется на S100-негативных миофибробластоподобных клетках, расположенных диффузно между S100-позитивными меланоцитарными, в свою очередь негативных к SMA (см. рис. 2, д). Мы обнаружили только одну работу, содержащую результаты аналогичного исследования [14]. Количество актин-позитивных клеток было взаимосвязано со степенью межклеточной коллагенизации и уменьшалось в более клеточных участках смешанных десмопластических и саркоматоидных разновидностей, где носило межпучковый характер. Эти клетки отсутствовали в веретеноклеточных нодулярных и поверхностно распространяющихся меланомах, а также в соответствующей части комбинированных форм.

Проведенный анализ генов BRAF и NRAS, являющихся наиболее частыми в меланомах, обнаружил наличие мутаций в гене BRAF в 23% веретеноклеточных меланом, что полностью коррелировало с иммуноэкспрессией BRAF (см. рис. 2, е; рис. 3). Мутации в гене NRAS были выявлены в 8% случаев. При этом меланомы десмопластического типа не несли вышеуказанных мутаций (табл. 2), что совпадает с результатами других исследователей [15, 16].

Таблица 2. Анализ статуса генов BRAF и NRAS в меланомах веретеноклеточного спектра

Рис. 3. Статус онкогена BRAF в нодулярной веретеноклеточной меланоме: выявлена замена с.1799Т>А (V600E). а — результаты HRMA (зеленая кривая — образец без мутации, красная — образец с мутацией V600E, исследуемый образец указан стрелкой); б — результаты секвенирования (с.1799Т>А).

Заключение

Полученные результаты указывают на вариантную гетерогенность спектра меланом, объединенных морфологическим феноменом веретеноклеточности, что подтверждается как на клинико-морфологическом, так и на иммуногистохимическом и молекулярно-генетическом уровнях.

Нюансы иммунофенотипа и генетические особенности веретеноклеточных меланом могут быть использованы для корректной диагностики и выбора оптимальной лечебной тактики.

Участие авторов:

Концепция и дизайн: К.В.Ш., Е.Н.И.

Сбор и обработка материала: В.А.Х., А.Г.И.

Статистическая обработка данных: В.А.Х., А.Г.И.

Написание текста: К.В.Ш., В.А.Х.

Редактирование: К.В.Ш.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail