Золотова Н.А.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН; Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Кирюхин С.О.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН; Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Хочанский Д.Н.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН

Добрынина М.Т.

Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Макарова О.В.

Государственная новосибирская областная клиническая больница

Морфологические изменения ободочной кишки при экспериментальном хроническом колите, индуцированном декстрансульфатом натрия

Журнал: Архив патологии. 2014;76(4): 29-34

Просмотров : 35

Загрузок : 1

Как цитировать

Золотова Н. А., Кирюхин С. О., Хочанский Д. Н., Добрынина М. Т., Макарова О. В. Морфологические изменения ободочной кишки при экспериментальном хроническом колите, индуцированном декстрансульфатом натрия. Архив патологии. 2014;76(4):29-34.

Авторы:

Золотова Н.А.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт морфологии человека" РАМН; Кафедра клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Все авторы (5)

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым традиционно относят болезнь Крона и язвенный колит, широко распространены среди населения [1, 2]. Возникновение ВЗК зависит от многих факторов (генотип, возраст, особенности питания, стрессы и др.), и их механизмы развития изучены недостаточно [3, 4]. Существующие методы лечения ВЗК не отличаются высокой эффективностью [3]. Большинство исследований, посвященных морфологическим изменениям толстой кишки при болезни Крона и язвенном колите, основано на изучении биопсийного материала, что не позволяет в полной мере оценить динамику развития воспалительного процесса и структурных изменений всех оболочек кишки.

Для изучения механизмов возникновения воспалительного процесса, оценки эффективности лекарственных препаратов широко используется адекватная и хорошо воспроизводимая экспериментальная модель язвенного колита, предложенная I. Okayasu и соавт. в 1990 г. - декстрансульфат натрия (ДСН), - индуцированный колит [5].

Механизм альтерирующего и провоспалительного действия ДСН на толстую кишку изучен недостаточно. Показано, что ДСН оказывает прямое цитотоксическое действие, вызывая нарушение проницаемости эпителиального барьера, транслокацию микрофлоры, воспалительный процесс с развитием эрозий и язв [6, 7]. ДСН фагоцитируется макрофагами слизистой оболочки толстой кишки, лимфатических узлов, печени и селезенки [8].

В ряде работ охарактеризованы некоторые морфологические изменения ободочной кишки при ДСН-индуцированном остром и хроническом колите у мышей [9-12]. Однако в указанных работах описаны изменения главным образом слизистой оболочки, а данные о морфологических изменениях стенки ободочной кишки при хроническом колите фрагментарны.

Цель настоящей работы - изучение морфологических изменений стенки ободочной кишки при хроническом колите, индуцированном ДСН у самцов мышей линии C57Bl/6.

Материал и методы

Исследование проводили на половозрелых самцах мышей линии C57Bl/6 (возраст 8-9 нед) и массой тела 18-22 г (n=20; филиал «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН, Россия). Поступившие в виварий ФГБУ НИИМЧ РАМН экспериментальные животные были помещены на 2-недельный карантин. Мышей содержали в открытой системе при температуре 18-22 °С и при естественном освещении, они получали в свободном доступе воду и комбикорм ПК-120-1 (сертификат соответствия №POCC RU.nO81.B00113, ГОСТ P50258-92).

Колит моделировали с помощью замены в поилках питьевой воды на 2% раствор ДСН (Dextran sulfate sodium salt Mr ~40,000, «Sigma», США). Животных разделили на 2 группы. 1-я группа (8 мышей), контрольная, на протяжении всего исследования получала обычную питьевую воду, а 2-я группа (12 мышей), опытная, - в течение 6 дней 2% водный раствор ДСН, затем - питьевую воду. Животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом на 21-е сутки эксперимента.

В ходе исследования проводили оценку клинических признаков колита: определяли массу тела перед началом эксперимента и при выведении из него, ежедневно регистрировали характер стула. Ободочную кишку извлекали из брюшной полости, разрезали по брыжейке, промывали забуференным изотоническим раствором натрия хлорида, расправляли на миллипоровом фильтре и помещали в фиксатор Буэна. После гистологической проводки кусочки заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином, по трехцветному методу Массона и Нисслю [13].

В гистологических срезах продольно ориентированной ободочной кишки, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали количество лимфоидных узелков (абсолютное число на 1 см длины среза, ув. 100). В слизистой оболочке ободочной кишки оценивали клеточный состав инфильтрата (среднее число клеток на 1 мм длины среза, ув. 100).

Проводили статистическую обработку данных методами непараметрической статистики. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного размаха (Me (0,25L;0,75U)). Сравнение результатов между группами проводили по U-критерию Манна-Уитни. Статистически значимыми считали значение при p<0,05. Для статистической обработки данных и построения диаграмм использовали пакеты Statistica 8.0 (StatSoft) и Excel MS Office 2010 (Microsoft).

Результаты

Статистически значимых различий показателей массы тела у мышей 1-й и 2-й групп перед началом и в конце эксперимента выявлено не было (1-я группа - контрольная: в начале эксперимента 25 г (22,26), при выведении из эксперимента 26 г (24,26) соответственно; хронический колит: 25 г (23,27) и 24,5 г (23,25)). На 3-й день потребления раствора ДСН у 2 из 10 мышей был выявлен жидкий стул, к концу 2-й недели жидкий стул определялся у максимального числа животных (6 из 8), к концу эксперимента он был у 2 из 8 животных. На 9-й и 14-й день эксперимента 2 мыши умерли.

При гистологическом исследовании ободочной кишки у мышей контрольной группы (рис. 1, а)

Рисунок 1. Морфологическая характеристика стенки кишки мышей-самцов C57Bl/6 контрольной группы (а, д) и основной группы (экспериментальный хронический колит) (б, в, г, е). а-г - окраска гематоксилином и эозином; а - эпителиальная выстилка непрерывна, крипты глубокие, их просветы узкие, подслизистая основа тонкая с небольшим количеством клеточных элементов, лимфатические сосуды с узким щелевидным просветом; б - участок ремоделирования слизистой оболочки с сохраненной эпителиальной выстилкой и уменьшением в ней бокаловидных клеток, расширенными извилистыми криптами, местами заполненными слизью; в - эпителизированный язвенный дефект; г - участок ремоделирования слизистой оболочки с ворсинчатой поверхностью; б-г - воспалительная инфильтрация слизистой оболочки; д, е - окраска стенки ободочной кишки по трехцветному методу Массона; е - фиброз собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистого слоя. а-г - ×100, д, е - ×200.
эпителиальная выстилка была непрерывна на протяжении всей слизистой оболочки, крипты глубокие, их просветы узкие. Подслизистая основа была тонкой с небольшим количеством клеточных элементов, представленных лимфоцитами, гистиоцитами, фиброцитами и фибробластами. Лимфатические сосуды подслизистого слоя были с узким щелевидным просветом.

Во 2-й группе (опытной) у животных на 21-е сутки эксперимента в ободочной кишке выявлялась морфологическая картина хронического колита (см. рис. 1, б-г). Отмечались ремоделирование слизистой оболочки, уменьшение числа крипт, деформация, расширение их просветов и заполнение слизью, была выражена воспалительная инфильтрация слизистой оболочки, представленная плазмоцитами, гистиоцитами и единичными нейтрофилами. По сравнению с контрольной группой у мышей с хроническим колитом в эпителиальной выстилке было снижено число бокаловидных клеток. Встречались участки с реэпителизацией язв, а также зоны, где слизистая оболочка имела ворсинчатый контур. В мышечном слое воспалительная инфильтрация из лимфоцитов и гистиоцитов была слабо выражена. По сравнению с контрольной группой мышей в опытной группе увеличилось число лимфоидных узелков, в части их выявлялись светлые центры (рис. 2).

Рисунок 2. Лимфоидные узелки в слизистой оболочке ободочной кишки при хроническом язвенном колите. а - абсолютное число лимфоидных узелков в слизистой оболочке на 1 см продольного среза ободочной кишки у мышей контрольной группы и основной группы (хронический язвенный колит); Me (0,25L; 0,75U), * - изменения статистически значимы по сравнению с контрольной группой; б - лимфоидные узелки в слизистой оболочке ободочной кишки при экспериментальном хроническом язвенном колите. Окраска гематоксилином и эозином. ×100.
При окраске по Массону соединительной ткани (см. рис. 1, д, е) в стенке кишки при хроническом колите отмечался выраженный диффузный и очаговый фиброз собственной пластинки слизистой оболочки, подслизистого и мышечного слоев.

По сравнению с мышами контрольной группы при хроническом колите выявлялось статистически значимое повышение показателей содержания плазмоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой основе ободочной кишки (см. таблицу).

В связи с тем что у больных язвенным колитом наблюдаются нарушения перистальтики кишечника [14], особый интерес представляет исследование состояния нервной системы, представленной в кишечнике двумя сплетениями: подслизистым и межмышечным. При хроническом колите у мышей в ганглиях как подслизистого, так и межмышечного сплетения выявлялись гиперхромные нейроны с явлениями кариолизиса, глиальные клетки были сохранены (рис. 3).

Рисунок 3. Межмышечные нервные ганглии ободочной кишки мышей контрольной группы (а) и основной (хронический язвенный колит) (б). а - ганглий, образованный нейронами и глиальными клетками. Цитоплазма нейронов интенсивно окрашена, ядро крупное светлое с хорошо контурирующимися ядрышками, глиальные клетки со слабо окрашенной цитоплазмой и светлым ядром; б - наряду с нейронами, не отличающимися от таковых в контрольной группе, выявляются гибнущие нейроны, в которых ядра не контурируются и цитоплазма окрашена интенсивней. Глиальные клетки не изменены. Окраска по методу Ниссля. ×400.

Обсуждение

Таким образом, при хроническом колите, индуцированном ДСН, у мышей-самцов линии C57Bl/6 в ободочной кишке выявлены ремоделирование слизистой оболочки с уменьшением числа бокаловидных клеток, крипт и их глубины, воспалительная инфильтрация из лимфоцитов, плазмоцитов и гистиоцитов, гиперплазия лимфоидной ткани, диффузный и очаговый склероз, альтеративные изменения нейронов подслизистого и межмышечного сплетений.

Полученные нами данные в целом согласуются с описанными в ряде работ морфологическими изменениями слизистой оболочки ободочной кишки при хроническом ДСН-индуцированном колите. Так, согласно данным литературы, в слизистой оболочке при ДСН-индуцированном хроническом колите наблюдаются выраженная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистого слоя, изменения архитектоники крипт. Просветы крипт расширяются, становятся извилистыми. Базальные отделы крипт не достигают мышечной пластинки. Расстояние между криптами увеличивается, а их число уменьшается [10, 12].

При хроническом ДСН-индуцированном колите в зонах эрозий и язв собственная пластинка слизистой оболочки замещается грануляционной тканью, выстланной кубическим эпителием. По данным некоторых исследователей, эпителизирующиеся язвенные дефекты слизистой оболочки наблюдаются у мышей линии С57Bl/6, а у мышей Balb/С они отсутствуют [12].

При ВЗК развивается фиброз слизистой оболочки и мышечного слоя [15]. Он характерен и для ДСН-индуцированного хронического язвенного колита. S. Ding и соавт. [16] проводили исследования ДСН-индуцированного колита на мышах-самцах линии C57Bl/6 с встроенной репортерной конструкцией проколлагена α1 с белком GFP и выявили в зонах воспалительных изменений активацию генов проколлагена α1 в слизистой и мышечной оболочках ободочной кишки. На основании данных по двойному иммунофлюоресцентному окрашиванию исследователи заключают, что ген проколлагена активируется главным образом в фибробластах и миофибробластах слизистой и мышечной оболочек. Однако отмечается, что в процесс могут быть вовлечены миоциты и интерстициальные клетки мышечной оболочки [16].

Изменения нервной системы толстой кишки при хроническом ДСН-индуцированном колите не описаны. Однако в исследовании B. Gulbransen и соавт. [11] показана гибель пуринергических нейронов межмышечного сплетения на 3-и сутки после 5-дневного потребления 3% раствора ДСН. Исследователи полагают, что нейроны гибнут путем апоптоза, индуцированного паннексином-1 (Panx-1) - белковым каналом для АТФ. Избыток АТФ в участке воспаления приводит к сверхактивации P2X7-рецептора, связанного с паннексинами, и активации каспазного пути. Это приводит к гибели значительного числа нейронов, но не глиальных клеток, на которых ни паннексин-1, ни Р2Х7-рецептор не выявляется.

Отмеченные нами изменения в ободочной кишке у мышей в определенной мере соответствуют изменениям толстой кишки у больных язвенным колитом [17]. При язвенном колите у больных также наблюдается локализация поражения в толстой кишке, выражены воспалительная инфильтрация слизистой оболочки преимущественно из лимфоцитов и плазмоцитов с примесью нейтрофильных лейкоцитов, эпителизация язв, укорочение и деформация крипт, ворсинчатая деформация поверхности слизистой оболочки, склерозирование мышечной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы, увеличение числа лимфоидных узелков.

Таким образом, морфологические проявления хронического колита, индуцированного ДСН у самцов мышей линии C57Bl/6, во многом соответствуют язвенному колиту у человека. С помощью этой экспериментальной модели можно исследовать механизмы возникновения и развития данного заболевания, а также проводить доклиническую оценку эффективности лекарственных средств.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.В.М., С.О.К., Д.Н.Х., Н.А.З.

Сбор и обработка материала: С.О.К., Д.Н.Х., Н.А.З., М.Т.Д.

Статистическая обработка данных: С.О.К., Н.А.З.

Написание текста: Н.А.З., С.О.К.

Редактирование: О.В.М.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail