Колоректальный рак (КРР) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний в мире, занимает 3-е место после рака молочной железы и легких [1]. По разным данным, от 14,5 до 50% пациентов с КРР на момент обращения к врачу уже имеют метастазы в печени и около 50% больных страдают от метастатического поражения печени в ходе заболевания [2]. Единственным потенциально эффективным методом лечения метастазов КРР в печени является хирургический в сочетании с химиотерапевтическим и таргетной терапией. В настоящее время в стандартные схемы предоперационного лечения входят цитотоксические препараты (оксалиплатин или иринотекан), для повышения эффективности терапии в комбинации с ними применяются таргетные препараты, направленно воздействующие на молекулы, участвующие в канцерогенезе. Одним из таргетных препаратов, используемых при КРР, является бевацизумаб, представляющий собой моноклональное антитело к VEGF-A и ингибирующий ангиогенез в ткани опухоли, препятствуя ее росту и метастазированию.

Несмотря на то что механизмы действия каждого отдельного препарата в целом известны, изменения других свойств опухолевых клеток после воздействия различных химиотерапевтических схем остаются неизвестными. В последние годы особое внимание уделяется исследованию адгезивных свойств опухолевых клеток, однако их изменения под действием химиотерапии мало изучены [3].

Одними из основных элементов межклеточной адгезии как в нормальной, так и в опухолевой ткани являются молекулы кадгеринов и катенинов. В эпителиальных тканях в структуре плазматических мембран эпителиоцитов основным белком, обеспечивающим межклеточные взаимодействия, является гликопротеин Е-кадгерин, нарушения экспрессии которого часто наблюдаются при КРР [4]. Многочисленные исследования указывают на клиническую значимость данного белка в развитии КРР. Установлена четкая корреляция снижения или исчезновения экспрессии Е-кадгерина в мембране клеток и появления цитоплазматической экспрессии в клетках первичных аденокарцином со степенью дифференцировки, глубиной прорастания, увеличением стадии опухолевого процесса, с появлением гематогенных метастазов [4—6], поражением регионарных лимфатических узлов [7], со значительным снижением общей выживаемости [8]. Аберрантная цитоплазматическая экспрессия указывает на большую вероятность рецидива заболевания; уменьшение мембранной экспрессии указывает на плохой прогноз при раке толстой кишки [9].

Несмотря на наличие такого большого количества исследований экспрессии Е-кадгерина в клетках КРР и его метастазов, в настоящее время остается практически не изученным влияние на него различных химиотерапевтических и таргетных препаратов. Существуют лишь единичные работы, посвященные изучению изменения адгезивных свойств опухолевых клеток под действием терапии цитотоксическими препаратами [10].

β-Катенин, расположенный в норме преимущественно на клеточной мембране, связывается с внутриклеточным доменом E-кадгерина с одной стороны, с α-катенином и актиновыми волокнами клетки — с другой. Таким образом, β-катенин обеспечивает прочные межклеточные контакты и участвует в организации цитоскелета [11]. При поступлении специфических сигналов его концентрация в цитоплазме увеличивается, и часть молекул транспортируется в ядро, где он обнаруживается только в опухолевых клетках. Ядерный β-катенин активирует транскрипцию ряда генов в Wnt-пути передачи сигналов и таким образом инициирует клеточную пролиферацию [1, 2, 12].

Сегодня во многих работах подтверждается клиническая значимость нарушения экспрессии β-катенина [13]. Наиболее важное прогностическое значение при КРР принадлежит ядерному β-катенину. По результатам ряда работ, накопление белка в ядрах опухолевых клеток коррелирует с глубиной прорастания, поздними стадиями развития КРР, сосудистой инвазией, наличием метастазов в печени и худшим прогнозом выживаемости [5, 7, 14, 15]. Имеются работы, посвященные исследованию, в которых показано накопление β-катенина в ядрах опухолевых клеток в метастазах в печени [11], а также повышенная мембранно-цитоплазматическая экспрессия по сравнению с первичной опухолью [4]. Однако изменение экспрессии β-катенина под действием различных схем лекарственной терапии метастатического КРР остается также неизученным.

Рядом авторов продемонстрировано наличие связи нарушения экспрессии одновременно Е-кадгерина и β-катенина в опухолевых клетках первичных опухолей с клинико-морфологическими параметрами. Так, T. Matsuoka и соавт. [16] отметили снижение степени дифференцировки, увеличение стадии заболевания, сокращение общей выживаемости на фоне уменьшения мембранной экспрессии Е-кадгерина и β-катенина в первичной опухоли. В исследовании A. Filiz и соавт. [17] показано, что редукция мембранного β-катенина и накопление его в цитоплазме ассоциируются со степенью дифференцировки опухоли и вместе со снижением мембранной экспрессии Е-кадгерина достоверно связаны с уменьшением выживаемости после радикального лечения первичной опухоли.

Поскольку снижение содержания или аномальная экспрессия любого из компонентов кадгерин-катенинового комплекса приводит к уменьшению межклеточной адгезии и увеличивает вероятность дальнейшей инвазии и метастазирования, то представляется необходимым изучение межклеточных взаимодействий метастатических опухолей [4, 15—19], а также влияния на них различных схем цитотоксической и таргетной терапии.

Цель исследования — изучение экспрессии Е-кадгерина и β-катенина в метастазах КРР в печени с целью определения воздействия цитотоксических и комбинации цитотоксических и анти-VEGF-препаратов на адгезивные свойства опухолевых клеток.

Исследование выполнено на операционном материале метастазов КРР в печени, полученном от 73 пациентов РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского. Из них 31 пациент (возраст от 27 до 72 лет, медиана возраста 57 лет) получал предоперационную терапию цитотоксическими препаратами в качестве первой линии в режиме FOLFOX6 (оксалиплатин 85 мг/м², лейковорин 400 мг/м², 5-фторурацил (5-ФУ) болюсно 400 мг/м² с последующей 46-часовой инфузией 5-ФУ в дозе 2400 мг/м²) либо в режиме FOLFIRI (иринотекан 180 мг/м², лейковорин 400 мг/м², 5-ФУ болюсно 400 мг/м² с последующей 46-часовой инфузией 5-ФУ в дозе 2400 мг/м²). У 11 больных (возраст от 46 до 75 лет, медиана возраста 57 лет) была проведена комбинированная цитотоксическая и таргетная анти-VEGF-терапия также в качестве первой линии, при которой пациенты получали в 1-й день бевацизумаб в дозе 5 мг/кг. Группу сравнения составил 31 пациент с метастазами в печени (возраст от 39 лет до 71 года, медиана возраста 59 лет), этим больным лекарственная терапия не проводилась.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, осуществляли проводку на гистопроцессоре, после чего заливали в парафин. Для гистологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином; для ИГХ-исследования срезы толщиной также 3—4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла. Депарафинирование и ИГХ-исследование проводились по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистохимическом стейнере Bond-Max («Leica»). Использовали первичные антитела к Е-кадгерину («Dako», клон NCH-38, разведение 1:30) и β-катенину («Dako», клон β-катенин-1, разведение 1:200).

Затем препараты изучали с помощью световой микроскопии. Интенсивность окрашивания при иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом: – — отсутствие экспрессии, + — слабая, ++ — умеренная и +++ — выраженная интенсивность экспрессии. Для анализа результатов степени выраженности экспрессии были объединены в 2 группы: – и + — низкая, ++ и +++ — высокая экспрессия. При этом исследовали прежде всего локализацию маркеров: мембранная, мембранно-цитоплазматическая, цитоплазматическая для Е-кадгерина и мембранно-цитоплазматическая и ядерная для β-катенина. Визуализацию изображения осуществляли с помощью цифровой камеры («Leica»).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием точного метода Фишера. Статистическая значимость принималась при p<0,05.

При ИГХ-исследовании экспрессии Е-кадгерина в метастазах КРР в печени пациентов, получавших предоперационную терапию цитотоксическими препаратами, выявлена его нормальная мембранная локализация в 32% (10 пациентов) случаев; в остальных 68% (21 пациент) случаев отмечалась мембранно-цитоплазматическая экспрессия. В группе сравнения мембранная экспрессия выявлена у меньшего количества пациентов (16%, или 5 человек), чем в группе леченых больных, а мембранно-цитоплазматическая, напротив, — у большего количества (74%, или 23 человека). Следовательно, мембранная экспрессия отмечалась чаще у пациентов, леченных цитотоксическими препаратами, а патологическая мембранно-цитоплазматическая локализация маркера встречалась чаще в группе нелеченых больных, хотя статистически достоверной разницы между группами не выявлено (р>0,05). Кроме того, в группе больных, не получавших химиотерапевтическое лечение, выявлены отсутствие Е-кадгерина и его аберрантная цитоплазматическая экспрессия в 3 и 6% случаев соответственно (табл. 1).

Выраженность экспрессии данного маркера также отличалась в двух группах. У больных, получавших химиотерапевтическое лечение, превалировала низкая мембранная (22% случаев, 7 пациентов), высокая мембранная экспрессия встречалась в 10% (3 пациента) случаев. При этом в контрольной группе отмечалась обратная картина: слабая интенсивность мембранной экспрессии у 3%, выраженная у 13% пациентов (различия недостоверны; р=0,12). Мембранно-цитоплазматическая экспрессия, напротив, у пациентов из группы, получавших химиотерапию, чаще была высокая (58% случаев, 18 человек), чем низкая (10%, 3 человека), так же как и в группе сравнения (выраженная в 45%, слабая в 14% случаев) (см. табл. 1). Однако статистически достоверных различий между данными группами не выявлено (р=0,09).

Таким образом, в нашем исследовании лечение цитотоксическими препаратами привело к некоторому увеличению количества случаев с нормальной мембранной локализацией молекулы адгезии Е-кадгерина по сравнению с группой пациентов, не получавших химиотерапевтическое лечение. В настоящее время существуют лишь единичные работы, посвященные изучению изменения адгезивных свойств опухолевых клеток метастатических очагов КРР под действием терапии цитотоксическими препаратами. Этими авторами получены данные об отсутствии разницы в экспрессии Е-кадгерина в метастазах КРР в печени пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение до операции и не получавших его [10]. Вместе с тем усиление адгезивных свойств опухолевых клеток под действием цитотоксической терапии даже у небольшого числа пациентов представляется важным в связи с тем, что эти изменения опухолевой ткани улучшают дальнейший прогноз.

Анализ экспрессии Е-кадгерина в метастазах КРР в печени пациентов, получавших сочетанную терапию цитотоксическими и анти-VEGF-препаратами (бевацизумаб), показал статистически значимые отличия от контрольной группы (р=0,00043). В 1-й группе отмечалась преимущественно нормальная мембранная экспрессия (9 пациентов, 82%), в то время как во 2-й — аномальная мембранно-цитоплазматическая (23 пациента, 74%) (см. рис. 1). В 1-й группе низкая мембранная экспрессия данного маркера отмечалась в 46% случаев, несколько реже — высокая мембранная экспрессия (36%); также выявлено 2 случая мембранно-цитоплазматической экспрессии выраженной интенсивности. При сравнении интенсивности экспрессии в этих двух группах статистически достоверных различий не получено. В группе леченых пациентов не выявлено случаев патологической цитоплазматической экспрессии Е-кадгерина или его отсутствия, в отличие от контрольной группы (см. табл. 1). Таким образом, при лечении бевацизумабом отмечается достоверное снижение количества случаев аномальной цитоплазматической локализации Е-кадгерина.

При сравнении экспрессии Е-кадгерина в группах пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами в сочетании с анти-VEGF-таргетным препаратом и терапию только цитотоксическими препаратами, выявлено, что в 1-й группе достоверно чаще встречалась мембранная локализация маркера (р=0,01).

Таким образом, добавление к цитотоксической химиотерапии таргетного препарата бевацизумаба привело к тому, что в большинстве метастатических очагов молекула межклеточной адгезии Е-кадгерин приобрела свою нормальную мембранную локализацию, что свидетельствует о положительном влиянии терапии FOLFOX6 в сочетании с таргетным препаратом на адгезивные свойства опухолевых клеток. Следовательно, выявление мембранной экспрессии Е-кадгерина, подавляющего инвазию опухолевых клеток, может служить показателем эффективности сочетанной цитотоксической и таргетной анти-VEGF-терапии.

При исследовании β-катенина в метастазах КРР в печени выявлена аномальная смешанная мембранная и цитоплазматическая локализация, а также в ряде случаев — еще и ядерная. Кроме того, необходимо отметить, что ядерная локализация β-катенина наиболее выражена по периферии метастатических очагов. Анализ экспрессии β-катенина в метастазах КРР в печени пациентов, получавших предоперационную химиотерапию цитотоксическими препаратами, показал, что сочетание мембранно-цитоплазматической и ядерной экспрессии встречалось примерно с такой же частотой, как и мембранно-цитоплазматическая экспрессия (52%, 16 пациентов и 48%, 15 пациентов соответственно) (см. рисунок, в, г). В контрольной группе отмечено некоторое преобладание мембранно-цитоплазматической экспрессии (58%, 18 больных). Отличия между группами недостоверны (р=0,46). При этом у больных, как получавших химиотерапевтическое лечение, так и не получавших его, превалировала высокая интенсивность мембранно-цитоплазматической экспрессии (38 и 55% случаев соответственно). При наличии ядерной локализации β-катенина выявлена его выраженная мембранно-цитоплазматическая экспрессия у 52% (16 человек) леченых пациентов и у 39% (12 человек) из контрольной группы (табл. 2). Отличия в выраженности экспрессии данного маркера статистически достоверных значений не достигли.

Сопоставление содержания β-катенина после проведения сочетанной терапии цитотоксическими препаратами и бевацизумабом с контрольной группой выявило большее количество случаев без ядерной экспрессии в первой группе, чем во второй (64 и 58% случаев соответственно; р>0,05). У пациентов, получавших сочетанную терапию, так же как и у нелеченых пациентов, превалировала высокая мембранно-цитоплазматическая экспрессия данного маркера как при наличии ядерной экспрессии (36% случаев), так и при ее отсутствии (55% случаев). Низкое содержание β-катенина не обнаружено у пациентов с ядерной экспрессией и отмечено лишь в 9% случаев без ядерной экспрессии (см. табл. 2). Статистически достоверных различий между данными группами в зависимости от интенсивности экспрессии также не выявлено.

Сравнение содержания β-катенина в двух группах пациентов, получавших предоперационную терапию, достоверной разницы не показало (р=0,49).

По данным разных авторов, интенсивность иммунореактивности β-катенина при КРР, как правило, выраженная в большинстве случаев и колеблется от 62% [20] до 77% [1] в первичных опухолях и достигает 93% в метастазах в печени [4], что согласуется с нашими данными. При этом аномальная ядерная локализация белка часто присутствует как в первичных опухолях, составляя, по данным разных авторов, от 42% [20] до 80% [1], так и в метастатических отсевах в печени, доходя до 100% [11]. В нашем исследовании ядерная экспрессия β-катенина выявлена у 42% пациентов, не проходивших предоперационную терапию, у 52% больных, леченных цитотоксическими препаратами, и у 36%, получавших сочетанную терапию. Нам не удалось найти в литературе сведений о влиянии изучаемых химиотерапевтических и таргетных препаратов на содержание β-катенина в опухолевых клетках. По нашим данным, добавление анти-VEGF-препарата приводило к некоторому уменьшению количества случаев с ядерной локализацией белка по сравнению как с контрольной группой, так и с группой пациентов, получавших цитотоксическую терапию.

Нами проведен анализ соотношения локализации и интенсивности экспрессии Е-кадгерина и β-катенина в метастазах КРР в печени во всех трех группах. Для изучения соотношения интенсивности экспрессии Е-кадгерина и β-катенина были выделены 4 подгруппы: высокая экспрессия обоих маркеров (Е-кадгерин+/β-катенин+), высокая экспрессия Е-кадгерина при низкой β-катенина (Е-кадгерин+/β-катенин–), низкая экспрессия Е-кадгерина при высокой β-катенина (Е-кадгерин–/β-катенин+), низкая экспрессия обоих белков (Е-кадгерин–/β-катенин–) (табл. 3). Статистически достоверных различий между группами нами не обнаружено. Во всех трех группах преобладала выраженная экспрессия обоих маркеров. В контрольной группе также в значительном количестве случае отмечено сочетание слабой экспрессии Е-кадгерина с высокой β-катенина (36% пациентов).

Для сопоставления их локализации в опухолевых клетках было выделено 7 вариантов сочетания экспрессии Е-кадгерина/β-катенина (табл. 4). В группе пациентов, леченных цитотоксическими препаратами, так же как и в контрольной группе, превалировала аномальная мембранно-цитоплазматическая локализация Е-кадгерина в сочетании либо с мембранно-цитоплазматической экспрессией β-катенина (36% в первой группе и 46% — во второй), либо с наличием его мембранной, цитоплазматической и ядерной локализации (32 и 29% соответственно). При добавлении к терапии таргетного анти-VEGF-препарата начинало преобладать сочетание нормальной мембранной локализации Е-кадгерина с мембранно-цитоплазматической экспрессией β-катенина (46% случаев; р=0,009 по сравнению с контрольной группой), несколько реже — в сочетании с ядерной локализацией β-катенина (36% пациентов; р=0,06 по сравнению с группой контроля). При сравнении локализации данных белков в опухолевых клетках в группах пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами в сочетании с анти-VEGF-препаратом и терапию только цитотоксическими препаратами, выявлено, что в 1-й группе достоверно чаще встречалась мембранная экспрессия Е-кадгерина в сочетании с мембранно-цитоплазматической β-катенина (р=0,04) и снижалось количество случаев мембранной экспрессии Е-кадгерина в сочетании с ядерной локализацией β-катенина (р=0,04).

Нарушение экспрессии и соответственно функции любого из элементов комплекса Е-кадгерин/β-катенин приводит к нарушению межклеточных контактов, накоплению β-катенина в ядре и повышению его транскрипционной активности. В несвязанном с E-кадгерином состоянии β-катенин может функционировать как фактор транскрипции. Накапливаясь в цитоплазме, β-катенин участвует в трансдукции сигнала, формируя активные транскрипционные комплексы с другими белками, которые перемещаются в ядро и трансактивируют определенные гены Wnt-пути передачи сигналов. В результате стимулируется пролиферация клеток и увеличивается их способность к инвазии [1, 4, 11, 12]. В нашем исследовании в метастазах КРР в печени как пациентов, не получавших предоперационную терапию, так и леченных по схеме FOLFOX6, в большинстве случаев отмечено нарушение кадгерин-катенинового комплекса, а именно наличие аберрантной цитоплазматической экспрессии Е-кадгерина и цитоплазматической и ядерной β-катенина. Такие изменения приводят к нарушению межклеточной адгезии и функционированию β-катенина в качестве транскрипционного фактора, усиливающего пролиферацию опухолевых клеток. Добавление таргетного анти-VEGF-препарата к цитотоксической терапии приводило к восстановлению нормальной локализации Е-кадгерина в клетках и снижению количества случаев ядерной экспрессии β-катенина. При восстановлении мембранной локализации Е-кадгерина в клетке его внутриклеточный домен связывается с β-катенином и последний перестает функционировать в качестве транскрипционного фактора, а взаимодействует с актиновыми микрофиламентами и участвует в организации межклеточных контактов. Следовательно, бевацизумаб оказывает положительное влияние на кадгерин-катениновый комплекс в клетках метастатического КРР.

В проведенном исследовании экспрессии Е-кадгерина в метастазах КРР в печени выявлено достоверное увеличение количества случаев нормальной мембранной локализации Е-кадгерина, что улучшает адгезивные свойства опухолевых клеток в группе пациентов, получавших сочетанную предоперационную терапию цитотоксическими и таргетным анти-VEGF-препаратом, по сравнению как с контрольной группой, так и с пациентами, леченными только цитотоксическими препаратами.

Сопоставление локализации Е-кадгерина и β-катенина в опухолевых клетках показало, что добавление к терапии таргетного анти-VEGF-препарата приводило к преобладанию сочетания нормальной мембранной локализации Е-кадгерина с мембранно-цитоплазматической экспрессией β-катенина по сравнению с контрольной группой и с пациентами, получавшими только FOLFOX6, а также достоверно снижало количество случаев мембранной экспрессии Е-кадгерина в сочетании с аномальной ядерной локализацией β-катенина по сравнению с группой, получавшей только цитотоксическую химиотерапию.

Таким образом, добавление бевацизумаба к лекарственной терапии метастатического КРР положительно влияет на кадгерин-катениновый комплекс, приводя к усилению межклеточных контактов и подавлению функционирования β-катенина в качестве транскрипционного фактора, увеличивающего пролиферацию опухолевых клеток.

Работа выполнена в рамках проекта, поддержанного Российским фондом фундаментальных исследований, № 14−04−00844.

Участие авторов:

Сбор и обработка материала: Е.М.П., А.В.В., М.И.С., Д.Н.Ф.

Статистическая обработка: А.В.В.

Написание текста: Е.М.П.

Редактирование: О.Г. С.

Конфликт интересов отсутствует.