Мотин Ю.Г.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Лепилов А.В.

ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России, Барнаул, Россия

Ларионов П.М.

ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России, Новосибирск, Россия

Морфологические изменения почки при экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Журнал: Архив патологии. 2017;79(2): 41-47

Просмотров : 108

Загрузок :

Как цитировать

Мотин Ю. Г., Лепилов А. В., Ларионов П. М. Морфологические изменения почки при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Архив патологии. 2017;79(2):41-47. https://doi.org/10.17116/patol201779241-47

Авторы:

Мотин Ю.Г.

КГБУЗ «Краевая клиническая больница»

Все авторы (3)

Начальная стадия процессов формирования мочевых камней и сопровождающие его патоморфологические и ультраструктурные изменения почки у человека протекают в большинстве случаев бессимптомно, что затрудняет установление причин и механизмов литогенеза при мочекаменной болезни.

В последние годы все более широко обсуждается роль местных факторов в развитии нефролитиаза. Ведущая роль в инициации литогенных процессов принадлежит петле нефрона и собирательным трубкам, что объясняется особенностями их морфологической организации, наличием противоточно-множительной системы и замедлением тока мочи [1]. При этом большинство авторов сходятся во мнении, что процессы литогенеза не являются простым физико-химическим нарушением и только пресыщение мочи солями не может вызвать образование мочевых камней [2, 3]. Моча у здорового человека может содержать высокие концентрации солей оксалата и фосфата кальция, но мочекаменная болезнь развивается далеко не у всех, что связывается с присутствием в моче особых белковых макромолекул ингибиторов кристаллизации. Нарушение функции этих молекул рассматривается как один из пусковых моментов формирования мочевых камней [4]. Ранее нами получены данные, свидетельствующие о нарушении синтеза белков-модуляторов процессов кристаллизации на начальных сроках развития литогенных процессов в почке [5]. Это позволило предположить, что причиной этому может являться нарушение процесса конформационных преобразований белков, что ведет к накоплению аберрантных несвернутых или неправильно свернутых протеинов, т. е. процессу, лежащему в основе развития стресса эндоплазматического ретикулума (ЭПР-стресса). Этот изначально регуляторный механизм, позволяющий клетке адаптироваться к метаболическим изменениям окружающей среды, в настоящее время все более широко обсуждается как общее звено патогенеза многих заболеваний человека [6, 7].

Индикатором развития ЭПР-стресса может служить увеличение экспрессии шаперона ЭПР GRP-78 [8]. Также показана способность GRP-78 связывать ионы кальция и блокировать активацию ЭПР-ассоциированных проапоптотических факторов, тем самым опосредуя компенсаторную ветвь ЭПР-стресса [9]. Однако, в условиях развивающегося патологического процесса и невозможности адаптации клетка следует по пути запрограммированной гибели, подвергаясь апоптозу. Этот процесс индуцируется протеином GADD153 (growth arrest and DNA damage inducible genes — белок, вызывающий прекращение роста и повреждение ДНК), также известным как CHOP (CCAAT/enhancer-binding protein-homologus protein) [10]. Морфофункциональные и ультраструктурные особенности организации тканевых элементов почки позволяют предполагать участие каскадов ЭПР-стресса в развитии литогенных процессов. При этом, несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению ЭПР-стресса в почке при ряде заболеваний (врожденные и наследственные заболевания, поликистоз почек, гломерулонефриты, диабетическая нефропатия, повреждение, вызванное ишемией/реперфузией, воздействием ряда лекарственных препаратов, солями тяжелых металлов и др.), в современной литературе недостаточно освещены вопросы развития ЭПР-стресса и его проявления при нефролитиазе.

Таким образом, появившиеся в последние годы сведения указывают на возможную связь между интенсивностью процессов кристаллизации, нарушением экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и инициацией стресса ЭПР, что может создавать предпосылки для прогрессирующего повреждения тканевых структур почки и дальнейшего развития процессов литогенеза.

Цель исследования — оценить морфологические изменения почки на ранних сроках развития литогенных процессов и в условиях коррекции мочи оксалатхелатирующими средствами (цитратом натрия).

Материал и методы

Для адекватного воспроизведения процессов, протекающих в человеческом организме на начальных этапах развития мочекаменной болезни, использовали этиленгликолевую модель оксалатного нефролитиаза [11]. Исследование выполнено на 80 самцах крыс линии Wistar массой тела от 180 до 250 г.

Всех животных разделили на 4 группы по 20 крыс в каждой. Крысы 1-й группы получали в качестве питья водопроводную воду, мочекаменная болезнь не инициировалась. Данную группу использовали в качестве контрольной. Животные 2-й группы на фоне стандартной диеты в течение 21 сут получали вместо питьевой воды 1% водный раствор этиленгликоля при свободном доступе, что индуцировало развитие оксалатного экспериментального нефролитиаза [12]. Животные 3-й группы находились в условиях стандартной диеты в течение 42 сут и получали для питья 1% раствор этиленгликоля. Для оценки влияния интенсивности процессов кристаллизации на морфофункциональную перестройку тканевых элементов почки животные 4-й группы после 3-недельного потребления этиленгликоля на протяжении последующих 21 сут получали натрия цитрат (субстанция Sigma Aldrich, США, каталожный номер C3674) внутрь через зонд в дозе 200 мг/кг, при этом животные продолжали потреблять этиленгликоль.

Для гистологического исследования животных декапитировали путем дислокации шейного позвонка под эфирным наркозом с соблюдением требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других научных целей» (Страсбург, 1986) и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997. На данное исследование получено разрешение этического комитета Алтайского государственного медицинского университета. Материалом исследования послужила почка крысы. Орган фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали, заливали в парафин. Поперечные срезы, проходящие через почечный сосочек, толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления отложений соединений кальция использовали импрегнацию серебром по методу Косса. Определение функциональной активности клеток эпителия проводили при помощи окраски на аргентофильные белки ядрышкообразующих районов AgNORs («Bio-Optica», Италия).

Для определения экспрессии маркеров адаптивной (белок GRP78) и дизадаптивной (GADD153) ветвей ЭПР-стресса проводили непрямой двухшаговый стрептавидин-биотиновый метод. В качестве первичных антител использовали антитела к GRP78 (N-20: sc-1050), 1:50 и антитела к GADD153 (F-168: sc-575), 1:100 («Santa Cruz», США). Продукты реакции визуализировали с помощью системы Goat ABC Staining system: sc-2023 («Santa Cruz»), Rabbit ABC Staining system: sc-2018 («Santa Cruz») и диаминобензидина (ДАБ).

Для электронно-микроскопического исследования образцы почки фиксировали в 4% растворе параформа, приготовленном на буфере Хенкса, с дофиксацией в 1% растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH 7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 50—70 нм на ультратоме Leica EM UC7, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе Libra 120 («Carl Zeiss», Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ с последующим фотографированием при увеличениях от 4000 до 80 000.

Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.4LE. Степень экспрессии (в баллах — +, ++, +++) оценивали по интенсивности окрашивания ДАБ. Для удобства интерпретации результатов рассчитывали интенсивность экспрессии по формуле:

, 100¡Dx

E%=100 – ,

где E% — интенсивность экспрессии, 256 — максимум интенсивности окраски, Dx — интенсивность окрашивания ДАБ. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы SigmaPlot 11.0 («Systat Software Inc.», США). Оценку межгрупповых различий при равном числе наблюдений в группах проводили по критерию Данна. Оценку распределения качественных признаков осуществляли с помощью критерия хи-квадрат (χ2). Результаты работы представлены в виде значений ‾Х (средняя арифметическая) ± SD (стандартное отклонение).

Результаты

Инициация литогенных процессов в почках экспериментальных животных (моделирование оксалатного нефролитиаза в течение 3 нед) сопровождалась дистрофическими изменениями эпителия канальцев и собирательных трубок в виде гиалиново-капельной и гидропической дистрофии. Отложение соединений кальция (в среднем 17,1±2,0 в поле зрения) обнаруживалось в эпителии канальцев и собирательных трубок, в интерстиции мозгового вещества, просветах собирательных трубок в составе белковых цилиндров. Преимущественное отложение соединений кальция соответствовало зонам максимально выраженной патогистологической перестройки тканей почки в области основания и средней трети почечного сосочка. Средний размер депозитов составил 9,2±0,4 мкм (см. таблицу). Наблюдалось снижение функциональной биосинтетической активности эпителиоцитов. Показатели среднего количества AgNORs статистически значимо различались от показателей интактной группы и на 3-й неделе эксперимента составляли 1,29±0,1. Нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (68,2±2,4%), количество клеток с двумя AgNORs составляло 28,1±1,5%, с тремя и более AgNORs — 3,7±0,8%.

Морфофункциональные показатели внутренней зоны мозгового вещества почки (−Х±SD) Примечание. * — p<0,05 — статистическая значимость различий (по критерию Данна); ** — р<0,05 — статистически значимые различия от показателей интактной группы по критерию χ2.

Видимая при светооптическом изменении вакуолизация эпителиоцитов канальцев электронно-микроскопически проявлялась расширением цистерн гранулярного ЭПР и формированием различного размера вакуолей. Содержимое большинства из них было электронно-светлым хлопьевидным, на поверхности мембран определялись неравномерно расположенные рибосомы (рис. 1). Отмечались умеренные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны и правильного расположения крист. Цитоплазма клеток и отдельные увеличенные митохондрии содержали мелкие электронно-плотные депозиты кальция. Эндоплазматическая сеть таких клеток была значительно расширена. Иммуногистохимическое исследование показало умеренно выраженную (++) экспрессию GRP78 клеточной выстилкой почечных канальцев, статистически значимо не отличавшуюся от показателей контрольной группы. Однако следует отметить, что в местах интенсивного литогенеза экспрессия шаперона GRP78 была выраженной (+++), на 15% превышая показатели здоровых животных. Отмечена активация проапоптозной ветви ЭПР-стресса: выраженная (+++) экспрессия GADD153 (на 32,4% превышающая показатели контрольной группы; p<0,05). В местах интенсивного литогенеза, в областях отложения крупных депозитов кальция, выраженность экспрессии GADD153 была максимальной, на 58,3% превышая показатели интактной группы.

Рис. 1. Перинуклеарная зона эпителиоцита собирательной трубки при инициации литогенных процессов (экспериментальный нефролитиаз 3 нед). Расширенные цистерны гранулярного ЭПР содержат электронно-светлое хлопьевидное содержимое. Митохондрии набухшие, с просветлением матрикса, нарушением структуры и деструкцией крист. Здесь и на рис. 2—4: ×10 000.

Развитие литогенных процессов после 6 нед моделирования оксалатного нефролитиаза сопровождалось выраженной патогистологической перестройкой тканей почки с дистрофическими и некробиотическими изменениями клеток и внеклеточных структур. Отложения кальция располагались по всей площади почечного сосочка в больших количествах, в среднем 27,4±3,2 в поле зрения. Обнаруживаемые кальциевые депозиты были крупнее, в среднем составляя 11,8±0,6 мкм. Биосинтетическая активность эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок значительно снижалась: показатели среднего количества AgNORs составляли 1,27±0,2, нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (72,8±2,3%); количество клеток с двумя AgNORs составляло 25,9±1,2%; с тремя и более AgNORs — 1,3±0,9%.

Усиливалась выраженность ультраструктурных изменений эпителиоцитов канальцев и собирательных трубок. Расширение цистерн гранулярного ЭПР носило протяженный характер (рис. 2). На поверхности мембран определялись одиночные, неравномерно расположенные рибосомы. Ядра эпителиоцитов подвергались кариорексису и кариолизису. Характерными являлись уменьшение числа и выраженные ультраструктурные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны и структуры крист. В цитоплазме располагались гигантские митохондрии с набуханием, просветлением матрикса, выраженными деструктивными изменениями крист и мембран. Определялись мелкие электронно-плотные депозиты кальция, фиксированные в структурах цитоплазмы и внутри митохондрий на поврежденных кристах (рис. 3). Отмечалось формирование гигантских митохондрий с характерными ампулярно расширенными кристами.

Рис. 2. Ультраструктура эпителиоцита собирательной трубки почки при экспериментальном оксалатном нефролитиазе (6 нед). Нарушение структуры перинуклеарного компартмента гранулярного ЭПР, значительное расширение цистерн с нарушением расположения рибосом; деструктивные изменения митохондрий.

Рис. 3. Ультраструктура эпителиоцита собирательной трубки почки при экспериментальном оксалатном нефролитиазе (6 нед). а — гигантские митохондрии с просветлением матрикса, набуханием и деструкцией крист; б — фиксация соединений кальция (красные) в цитоплазме и на кристах митохондрий; метод спектроскопии энергетических потерь электронов.

Иммуногистохимическое исследование показало уменьшение экспрессии (+) GRP78 эпителиоцитами канальцев нефронов и собирательных трубок. В области средней трети и вершины почечного сосочка этот показатель оказался существенно сниженным, на 8,3% уступая значениям животных контрольной группы. В эпителиоцитах собирательных трубок, обтурированных мочевым камнем, снижение экспрессии шаперона достигало максимума и было на 21,7% ниже контрольных показателей. При этом отмечалась продолжающаяся активация проапоптозной ветви ЭПР-стресса: выраженная (+++) экспрессия GADD153 с превышением средних показателей контрольной группы на 24,6% (p<0,05). В области отложения соединений кальция отмечалось выраженное увеличение экспрессии GADD153 (+++) в цитоплазме клеток (на 49,8% больше показателя у здоровых животных).

При применении цитрата натрия в качестве хелатирующего средства в почках экспериментальных животных обнаруживались умеренно выраженные патоморфологические изменения тканевых структур. В эпителии канальцев нефронов и собирательных трубок коркового и мозгового вещества отмечались умеренные признаки гиалиново-капельной дистрофии. В мозговом веществе почки определялось значительное снижение содержания соединений кальция, располагавшихся относительно равномерно по всей площади почечного сосочка. Кальциевые депозиты мелкие, их средний размер составил 6,2±0,3 мкм. Показатели биосинтетической активности тканевых элементов почки статистически значимо не различались от показателей контрольной группы: количество ядрышковых организаторов — 1,4±0,4; процентное соотношение эпителиоцитов собирательных трубок с одним, двумя, тремя и более ядрышковыми организаторами составляло 54,9±4,1, 35,2±3,4 и 9,9±2,6% соответственно. Таким образом, наблюдалось значительное замедление процесса литогенеза: по сравнению с животными с моделью нефролитиаза в течение 42 сут количество кальциевых депозитов в тканях уменьшалось в 3,4 раза (p<0,001), а средний размер — в 1,9 раза (p<0,001).

Электронно-микроскопическое исследование показало умеренную выраженность ультраструктурных изменений эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок. Мембранные элементы гранулярного ЭПР нерезко расширены, отмечалось слабое набухание митохондрий с просветлением матрикса и незначительной сглаженностью крист (рис. 4). Определялось выраженное усиление экспрессии шаперона GRP78, на 10,2% превышающее показатели интактных животных (p<0,05). Уровень экспрессии GADD153 (+) в целом соответствовал показателям контрольной группы.

Рис. 4. Ультраструктура эпителиоцитов собирательной трубки на фоне корригирующего применения хелатирующих средств (цитрат натрия). Умеренное расширение цистрен гранулярного ЭПР, набухание митохондрий.

Обсуждение

Причины и механизмы литогенеза при мочекаменной болезни широко дискутируются вплоть до настоящего времени. Большинство исследователей сходятся во мнении, что существенную патогенетическую роль в этом процессе играет повреждение клеток и тканей. Формированию клинически значимых мочевых камней в чашечках и лоханках предшествует различной длительности период морфофункциональных изменений клеточных и тканевых элементов почки, протекающий бессимптомно. В проведенном исследовании в условиях экспериментальной модели оксалатного нефролитиаза оценивались морфологические изменения почки на ранних сроках развития литогенных процессов.

На начальных сроках развития патологического процесса при инициации отложения депозитов кальция в тканях почки характерным являлось распределение микролитов преимущественно в области основания и средней трети почечного сосочка, в эпителии канальцев и собирательных трубок, интерстиции мозгового вещества, просветах собирательных трубок в составе белковых цилиндров. Данные факты соответствуют данным литературы, связывающим начало литогенных процессов с элементами петли нефронов и собирательными трубками [1]. Однако не все исследователи считают сам факт отложения депозитов кальция в тканях почки достаточным для повреждения тканевых структур и начала течения литогенеза. Высказывается предположение о том, что в результате фагоцитарного поглощения кальция образуются кластеры гранул, предназначенные для хранения слаборастворимых кальциевых солей [2]. В эпителиальных клетках канальцев нефронов и собирательных трубок наблюдались умеренно выраженные изменения органелл и клеточных мембран, носящие, по-видимому, адаптационный характер. Следует обратить внимание, что ультраструктурные изменения клеток, в цитоплазме которых обнаруживались депозиты кальция, значительно более выражены, что подвергает сомнению тезис о физиологичности накопления депозитов кальция. При этом наблюдалось изменение функциональной биосинтетической активности эпителиоцитов: снижалось среднее количество гранул AgNORs в ядрах, более двух третей клеток (68,2%) имело один ядрышковый организатор. Снижение интенсивности процессов транскрипции в клетках является одним из проявлений активации шаперона GRP78: в результате разрыва его связи с киназой PERK инактивируются трансляционные факторы, в результате чего происходит выключение фазы трансляции белкового синтеза и отпадает необходимость усиленного фолдинга протеинов [6]. Несмотря на умеренно выраженную экспрессию данного маркера клеточной выстилкой почечных канальцев, статистически значимо не различавшуюся от показателей контрольной группы, в местах интенсивного литогенеза экспрессия GRP78 значительно превышала контрольные показатели здоровых животных, что указывает на развитие ЭПР-стресса в почке уже при инициации литогенных процессов. Этот факт подтверждается обнаруженными ультраструктурными изменениями ЭПР: расширением цистерн с нарушением расположения рибосом, а хлопьевидное содержимое в просвете может свидетельствовать о нарушении посттрансляционных изменений белков, в результате чего они накапливаются интралюминально. Наряду с усилением экспрессии шаперона GRP78 и выраженной экспрессии маркера GADD153 в гистотопографических зонах наблюдали интенсивно протекавшие процессы кристаллизации и отложения депозитов кальция, более чем в 2 раза превышавшие показатели здоровых животных. Выраженная экспрессия GADD153 в эпителиоцитах канальцев нефронов и собирательных трубок свидетельствует об активации проапоптозной ветви ЭПР-стресса уже на ранних сроках развития литогенных процессов.

На 6-й неделе моделирования оксалатного нефролитиаза депозиты кальция располагались по всей площади почечного сосочка, повреждения клеток эпителия были более выраженными, отмечались некробиотические изменения. В связи с этим значительно снижалась биосинтетическая активность эпителиоцитов в зонах интенсивного литогенеза, что подтверждается снижением среднего количества ядрышковых организаторов в ядрах эпителиоцитов, преобладанием клеток с одним AgNORs (до 72,8%). Причиной этого, вероятно, являлись выраженные ультраструктурные изменения органелл, мембран и ядер эпителия канальцев и собирательных трубок, обусловленные продолжающимся воздействием повреждающих агентов и усилением процессов литогенеза. Фиксация соединений кальция на клеточных мембранах и в цитоплазме указывает на их непосредственную роль в развитии указанных изменений. Значительные изменения касались митохондрий, что способствовало нарушению энергетического обмена и снижению уровня биосинтетических процессов в клетках. Интенсивное развитие литогенных процессов в клетках и тканях почки, невозможность их компенсации обусловливали развитее ЭПР-стресса со снижением уровня экспрессии шаперона GRP78 и продолжающейся активацией проапоптозной ветви стресса, способствовавшей усугублению структурной перестройки органа и развитию патологического процесса.

Таким образом, инициация литогенных процессов в почках характеризовалась ультраструктурными изменениями эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок, свидетельствовавшими о структурно-функциональной перестройке ЭПР, нарушении нормального течения процессов конформационных изменений клеточных протеинов со срывом адаптации и развитием ЭПР-стресса. Данный факт объясняет снижение общей биосинтетической активности эпителиоцитов и показанные нами ранее нарушения экспрессии белков-ингибиторов кристаллизации [5].

Интенсивность развития литогенных процессов тесным образом связана со степенью пресыщения мочи солями. Применение цитрата натрия в качестве хелатирующего средства проявлялось ослаблением интенсивности литогенеза: в тканях почки обнаруживалось значительно меньшее содержание мелких депозитов кальция. Следует обратить внимание, что, несмотря на 6-недельное моделирование процессов камнеобразования, выраженность ультраструктурных изменений эпителия канальцев нефронов и собирательных трубок была умеренной, а их биосинтетическая активность статистически значимо не различалась от показателей здоровых животных. Наблюдавшееся в этих условиях усиление экспрессии шаперона GRP78 носило, вероятно, компенсаторный характер и являлось проявлением активации компенсаторной ветви ЭПР-стресса в условиях замедления развития и снижения интенсивности литогенных процессов, что обусловливало меньшие морфологические изменения органа.

Заключение

На ранних сроках развития литогенных процессов еще до формирования клинически значимых крупных мочевых камней, локализованных в чашечках и лоханках, развиваются стереотипные гистотопографические и ультраструктурные изменения эпителия канальцев нефронов и собирательных трубок, способствующие прогрессированию процессов камнеобразования, нарушению клеточного гомеостаза с активацией стресса эндоплазматического ретикулума, нарушением синтеза или посттрансляционными изменениями белков-модуляторов литогенеза.

Выраженность морфофункциональных изменений тканевых элементов почки связана с интенсивностью процессов литогенеза: применение цитрата натрия в качестве хелатирующего средства снижает интенсивность этих процессов, способствует усилению синтеза шаперона GRP78, что обусловливает активацию компенсаторной ветви стресса эндоплазматического ретикулума, опосредует снижение повреждения эпителиальной выстилки канальцев нефронов и собирательных трубок и их ультраструктурные изменения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Г.М., А.В.Л., П.М.Л.

Сбор и обработка материала: Ю.Г.М.

Статистическая обработка: Ю.Г.М.

Написание текста: Ю.Г.М., А.В.Л., П.М.Л.

Редактирование: А.В.Л., П.М.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail