Начальная стадия процессов формирования мочевых камней и сопровождающие его патоморфологические и ультраструктурные изменения почки у человека протекают в большинстве случаев бессимптомно, что затрудняет установление причин и механизмов литогенеза при мочекаменной болезни.

В последние годы все более широко обсуждается роль местных факторов в развитии нефролитиаза. Ведущая роль в инициации литогенных процессов принадлежит петле нефрона и собирательным трубкам, что объясняется особенностями их морфологической организации, наличием противоточно-множительной системы и замедлением тока мочи [1]. При этом большинство авторов сходятся во мнении, что процессы литогенеза не являются простым физико-химическим нарушением и только пресыщение мочи солями не может вызвать образование мочевых камней [2, 3]. Моча у здорового человека может содержать высокие концентрации солей оксалата и фосфата кальция, но мочекаменная болезнь развивается далеко не у всех, что связывается с присутствием в моче особых белковых макромолекул ингибиторов кристаллизации. Нарушение функции этих молекул рассматривается как один из пусковых моментов формирования мочевых камней [4]. Ранее нами получены данные, свидетельствующие о нарушении синтеза белков-модуляторов процессов кристаллизации на начальных сроках развития литогенных процессов в почке [5]. Это позволило предположить, что причиной этому может являться нарушение процесса конформационных преобразований белков, что ведет к накоплению аберрантных несвернутых или неправильно свернутых протеинов, т. е. процессу, лежащему в основе развития стресса эндоплазматического ретикулума (ЭПР-стресса). Этот изначально регуляторный механизм, позволяющий клетке адаптироваться к метаболическим изменениям окружающей среды, в настоящее время все более широко обсуждается как общее звено патогенеза многих заболеваний человека [6, 7].

Индикатором развития ЭПР-стресса может служить увеличение экспрессии шаперона ЭПР GRP-78 [8]. Также показана способность GRP-78 связывать ионы кальция и блокировать активацию ЭПР-ассоциированных проапоптотических факторов, тем самым опосредуя компенсаторную ветвь ЭПР-стресса [9]. Однако, в условиях развивающегося патологического процесса и невозможности адаптации клетка следует по пути запрограммированной гибели, подвергаясь апоптозу. Этот процесс индуцируется протеином GADD153 (growth arrest and DNA damage inducible genes — белок, вызывающий прекращение роста и повреждение ДНК), также известным как CHOP (CCAAT/enhancer-binding protein-homologus protein) [10]. Морфофункциональные и ультраструктурные особенности организации тканевых элементов почки позволяют предполагать участие каскадов ЭПР-стресса в развитии литогенных процессов. При этом, несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению ЭПР-стресса в почке при ряде заболеваний (врожденные и наследственные заболевания, поликистоз почек, гломерулонефриты, диабетическая нефропатия, повреждение, вызванное ишемией/реперфузией, воздействием ряда лекарственных препаратов, солями тяжелых металлов и др.), в современной литературе недостаточно освещены вопросы развития ЭПР-стресса и его проявления при нефролитиазе.

Таким образом, появившиеся в последние годы сведения указывают на возможную связь между интенсивностью процессов кристаллизации, нарушением экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и инициацией стресса ЭПР, что может создавать предпосылки для прогрессирующего повреждения тканевых структур почки и дальнейшего развития процессов литогенеза.

Цель исследования — оценить морфологические изменения почки на ранних сроках развития литогенных процессов и в условиях коррекции мочи оксалатхелатирующими средствами (цитратом натрия).

Для адекватного воспроизведения процессов, протекающих в человеческом организме на начальных этапах развития мочекаменной болезни, использовали этиленгликолевую модель оксалатного нефролитиаза [11]. Исследование выполнено на 80 самцах крыс линии Wistar массой тела от 180 до 250 г.

Всех животных разделили на 4 группы по 20 крыс в каждой. Крысы 1-й группы получали в качестве питья водопроводную воду, мочекаменная болезнь не инициировалась. Данную группу использовали в качестве контрольной. Животные 2-й группы на фоне стандартной диеты в течение 21 сут получали вместо питьевой воды 1% водный раствор этиленгликоля при свободном доступе, что индуцировало развитие оксалатного экспериментального нефролитиаза [12]. Животные 3-й группы находились в условиях стандартной диеты в течение 42 сут и получали для питья 1% раствор этиленгликоля. Для оценки влияния интенсивности процессов кристаллизации на морфофункциональную перестройку тканевых элементов почки животные 4-й группы после 3-недельного потребления этиленгликоля на протяжении последующих 21 сут получали натрия цитрат (субстанция Sigma Aldrich, США, каталожный номер C3674) внутрь через зонд в дозе 200 мг/кг, при этом животные продолжали потреблять этиленгликоль.

Для гистологического исследования животных декапитировали путем дислокации шейного позвонка под эфирным наркозом с соблюдением требований Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других научных целей» (Страсбург, 1986) и Федерального закона Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997. На данное исследование получено разрешение этического комитета Алтайского государственного медицинского университета. Материалом исследования послужила почка крысы. Орган фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали, заливали в парафин. Поперечные срезы, проходящие через почечный сосочек, толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления отложений соединений кальция использовали импрегнацию серебром по методу Косса. Определение функциональной активности клеток эпителия проводили при помощи окраски на аргентофильные белки ядрышкообразующих районов AgNORs («Bio-Optica», Италия).

Для определения экспрессии маркеров адаптивной (белок GRP78) и дизадаптивной (GADD153) ветвей ЭПР-стресса проводили непрямой двухшаговый стрептавидин-биотиновый метод. В качестве первичных антител использовали антитела к GRP78 (N-20: sc-1050), 1:50 и антитела к GADD153 (F-168: sc-575), 1:100 («Santa Cruz», США). Продукты реакции визуализировали с помощью системы Goat ABC Staining system: sc-2023 («Santa Cruz»), Rabbit ABC Staining system: sc-2018 («Santa Cruz») и диаминобензидина (ДАБ).

Для электронно-микроскопического исследования образцы почки фиксировали в 4% растворе параформа, приготовленном на буфере Хенкса, с дофиксацией в 1% растворе ОsO₄ на фосфатном буфере (pH 7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 50—70 нм на ультратоме Leica EM UC7, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе Libra 120 («Carl Zeiss», Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ с последующим фотографированием при увеличениях от 4000 до 80 000.

Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ 1.43 и AxioVision 3.4LE. Степень экспрессии (в баллах — +, ++, +++) оценивали по интенсивности окрашивания ДАБ. Для удобства интерпретации результатов рассчитывали интенсивность экспрессии по формуле:

, 100¡Dx

E%=100 – ,

где E% — интенсивность экспрессии, 256 — максимум интенсивности окраски, Dx — интенсивность окрашивания ДАБ. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы SigmaPlot 11.0 («Systat Software Inc.», США). Оценку межгрупповых различий при равном числе наблюдений в группах проводили по критерию Данна. Оценку распределения качественных признаков осуществляли с помощью критерия хи-квадрат (χ²). Результаты работы представлены в виде значений ‾Х (средняя арифметическая) ± SD (стандартное отклонение).

Инициация литогенных процессов в почках экспериментальных животных (моделирование оксалатного нефролитиаза в течение 3 нед) сопровождалась дистрофическими изменениями эпителия канальцев и собирательных трубок в виде гиалиново-капельной и гидропической дистрофии. Отложение соединений кальция (в среднем 17,1±2,0 в поле зрения) обнаруживалось в эпителии канальцев и собирательных трубок, в интерстиции мозгового вещества, просветах собирательных трубок в составе белковых цилиндров. Преимущественное отложение соединений кальция соответствовало зонам максимально выраженной патогистологической перестройки тканей почки в области основания и средней трети почечного сосочка. Средний размер депозитов составил 9,2±0,4 мкм (см. таблицу). Наблюдалось снижение функциональной биосинтетической активности эпителиоцитов. Показатели среднего количества AgNORs статистически значимо различались от показателей интактной группы и на 3-й неделе эксперимента составляли 1,29±0,1. Нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (68,2±2,4%), количество клеток с двумя AgNORs составляло 28,1±1,5%, с тремя и более AgNORs — 3,7±0,8%.

Видимая при светооптическом изменении вакуолизация эпителиоцитов канальцев электронно-микроскопически проявлялась расширением цистерн гранулярного ЭПР и формированием различного размера вакуолей. Содержимое большинства из них было электронно-светлым хлопьевидным, на поверхности мембран определялись неравномерно расположенные рибосомы (рис. 1). Отмечались умеренные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны и правильного расположения крист. Цитоплазма клеток и отдельные увеличенные митохондрии содержали мелкие электронно-плотные депозиты кальция. Эндоплазматическая сеть таких клеток была значительно расширена. Иммуногистохимическое исследование показало умеренно выраженную (++) экспрессию GRP78 клеточной выстилкой почечных канальцев, статистически значимо не отличавшуюся от показателей контрольной группы. Однако следует отметить, что в местах интенсивного литогенеза экспрессия шаперона GRP78 была выраженной (+++), на 15% превышая показатели здоровых животных. Отмечена активация проапоптозной ветви ЭПР-стресса: выраженная (+++) экспрессия GADD153 (на 32,4% превышающая показатели контрольной группы; p<0,05). В местах интенсивного литогенеза, в областях отложения крупных депозитов кальция, выраженность экспрессии GADD153 была максимальной, на 58,3% превышая показатели интактной группы.

Развитие литогенных процессов после 6 нед моделирования оксалатного нефролитиаза сопровождалось выраженной патогистологической перестройкой тканей почки с дистрофическими и некробиотическими изменениями клеток и внеклеточных структур. Отложения кальция располагались по всей площади почечного сосочка в больших количествах, в среднем 27,4±3,2 в поле зрения. Обнаруживаемые кальциевые депозиты были крупнее, в среднем составляя 11,8±0,6 мкм. Биосинтетическая активность эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок значительно снижалась: показатели среднего количества AgNORs составляли 1,27±0,2, нарастало количество эпителиоцитов с одним ядрышковым организатором (72,8±2,3%); количество клеток с двумя AgNORs составляло 25,9±1,2%; с тремя и более AgNORs — 1,3±0,9%.

Усиливалась выраженность ультраструктурных изменений эпителиоцитов канальцев и собирательных трубок. Расширение цистерн гранулярного ЭПР носило протяженный характер (рис. 2). На поверхности мембран определялись одиночные, неравномерно расположенные рибосомы. Ядра эпителиоцитов подвергались кариорексису и кариолизису. Характерными являлись уменьшение числа и выраженные ультраструктурные изменения митохондрий в виде набухания, нарушения целостности внутренней мембраны и структуры крист. В цитоплазме располагались гигантские митохондрии с набуханием, просветлением матрикса, выраженными деструктивными изменениями крист и мембран. Определялись мелкие электронно-плотные депозиты кальция, фиксированные в структурах цитоплазмы и внутри митохондрий на поврежденных кристах (рис. 3). Отмечалось формирование гигантских митохондрий с характерными ампулярно расширенными кристами.

Иммуногистохимическое исследование показало уменьшение экспрессии (+) GRP78 эпителиоцитами канальцев нефронов и собирательных трубок. В области средней трети и вершины почечного сосочка этот показатель оказался существенно сниженным, на 8,3% уступая значениям животных контрольной группы. В эпителиоцитах собирательных трубок, обтурированных мочевым камнем, снижение экспрессии шаперона достигало максимума и было на 21,7% ниже контрольных показателей. При этом отмечалась продолжающаяся активация проапоптозной ветви ЭПР-стресса: выраженная (+++) экспрессия GADD153 с превышением средних показателей контрольной группы на 24,6% (p<0,05). В области отложения соединений кальция отмечалось выраженное увеличение экспрессии GADD153 (+++) в цитоплазме клеток (на 49,8% больше показателя у здоровых животных).

При применении цитрата натрия в качестве хелатирующего средства в почках экспериментальных животных обнаруживались умеренно выраженные патоморфологические изменения тканевых структур. В эпителии канальцев нефронов и собирательных трубок коркового и мозгового вещества отмечались умеренные признаки гиалиново-капельной дистрофии. В мозговом веществе почки определялось значительное снижение содержания соединений кальция, располагавшихся относительно равномерно по всей площади почечного сосочка. Кальциевые депозиты мелкие, их средний размер составил 6,2±0,3 мкм. Показатели биосинтетической активности тканевых элементов почки статистически значимо не различались от показателей контрольной группы: количество ядрышковых организаторов — 1,4±0,4; процентное соотношение эпителиоцитов собирательных трубок с одним, двумя, тремя и более ядрышковыми организаторами составляло 54,9±4,1, 35,2±3,4 и 9,9±2,6% соответственно. Таким образом, наблюдалось значительное замедление процесса литогенеза: по сравнению с животными с моделью нефролитиаза в течение 42 сут количество кальциевых депозитов в тканях уменьшалось в 3,4 раза (p<0,001), а средний размер — в 1,9 раза (p<0,001).

Электронно-микроскопическое исследование показало умеренную выраженность ультраструктурных изменений эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок. Мембранные элементы гранулярного ЭПР нерезко расширены, отмечалось слабое набухание митохондрий с просветлением матрикса и незначительной сглаженностью крист (рис. 4). Определялось выраженное усиление экспрессии шаперона GRP78, на 10,2% превышающее показатели интактных животных (p<0,05). Уровень экспрессии GADD153 (+) в целом соответствовал показателям контрольной группы.

Причины и механизмы литогенеза при мочекаменной болезни широко дискутируются вплоть до настоящего времени. Большинство исследователей сходятся во мнении, что существенную патогенетическую роль в этом процессе играет повреждение клеток и тканей. Формированию клинически значимых мочевых камней в чашечках и лоханках предшествует различной длительности период морфофункциональных изменений клеточных и тканевых элементов почки, протекающий бессимптомно. В проведенном исследовании в условиях экспериментальной модели оксалатного нефролитиаза оценивались морфологические изменения почки на ранних сроках развития литогенных процессов.

На начальных сроках развития патологического процесса при инициации отложения депозитов кальция в тканях почки характерным являлось распределение микролитов преимущественно в области основания и средней трети почечного сосочка, в эпителии канальцев и собирательных трубок, интерстиции мозгового вещества, просветах собирательных трубок в составе белковых цилиндров. Данные факты соответствуют данным литературы, связывающим начало литогенных процессов с элементами петли нефронов и собирательными трубками [1]. Однако не все исследователи считают сам факт отложения депозитов кальция в тканях почки достаточным для повреждения тканевых структур и начала течения литогенеза. Высказывается предположение о том, что в результате фагоцитарного поглощения кальция образуются кластеры гранул, предназначенные для хранения слаборастворимых кальциевых солей [2]. В эпителиальных клетках канальцев нефронов и собирательных трубок наблюдались умеренно выраженные изменения органелл и клеточных мембран, носящие, по-видимому, адаптационный характер. Следует обратить внимание, что ультраструктурные изменения клеток, в цитоплазме которых обнаруживались депозиты кальция, значительно более выражены, что подвергает сомнению тезис о физиологичности накопления депозитов кальция. При этом наблюдалось изменение функциональной биосинтетической активности эпителиоцитов: снижалось среднее количество гранул AgNORs в ядрах, более двух третей клеток (68,2%) имело один ядрышковый организатор. Снижение интенсивности процессов транскрипции в клетках является одним из проявлений активации шаперона GRP78: в результате разрыва его связи с киназой PERK инактивируются трансляционные факторы, в результате чего происходит выключение фазы трансляции белкового синтеза и отпадает необходимость усиленного фолдинга протеинов [6]. Несмотря на умеренно выраженную экспрессию данного маркера клеточной выстилкой почечных канальцев, статистически значимо не различавшуюся от показателей контрольной группы, в местах интенсивного литогенеза экспрессия GRP78 значительно превышала контрольные показатели здоровых животных, что указывает на развитие ЭПР-стресса в почке уже при инициации литогенных процессов. Этот факт подтверждается обнаруженными ультраструктурными изменениями ЭПР: расширением цистерн с нарушением расположения рибосом, а хлопьевидное содержимое в просвете может свидетельствовать о нарушении посттрансляционных изменений белков, в результате чего они накапливаются интралюминально. Наряду с усилением экспрессии шаперона GRP78 и выраженной экспрессии маркера GADD153 в гистотопографических зонах наблюдали интенсивно протекавшие процессы кристаллизации и отложения депозитов кальция, более чем в 2 раза превышавшие показатели здоровых животных. Выраженная экспрессия GADD153 в эпителиоцитах канальцев нефронов и собирательных трубок свидетельствует об активации проапоптозной ветви ЭПР-стресса уже на ранних сроках развития литогенных процессов.

На 6-й неделе моделирования оксалатного нефролитиаза депозиты кальция располагались по всей площади почечного сосочка, повреждения клеток эпителия были более выраженными, отмечались некробиотические изменения. В связи с этим значительно снижалась биосинтетическая активность эпителиоцитов в зонах интенсивного литогенеза, что подтверждается снижением среднего количества ядрышковых организаторов в ядрах эпителиоцитов, преобладанием клеток с одним AgNORs (до 72,8%). Причиной этого, вероятно, являлись выраженные ультраструктурные изменения органелл, мембран и ядер эпителия канальцев и собирательных трубок, обусловленные продолжающимся воздействием повреждающих агентов и усилением процессов литогенеза. Фиксация соединений кальция на клеточных мембранах и в цитоплазме указывает на их непосредственную роль в развитии указанных изменений. Значительные изменения касались митохондрий, что способствовало нарушению энергетического обмена и снижению уровня биосинтетических процессов в клетках. Интенсивное развитие литогенных процессов в клетках и тканях почки, невозможность их компенсации обусловливали развитее ЭПР-стресса со снижением уровня экспрессии шаперона GRP78 и продолжающейся активацией проапоптозной ветви стресса, способствовавшей усугублению структурной перестройки органа и развитию патологического процесса.

Таким образом, инициация литогенных процессов в почках характеризовалась ультраструктурными изменениями эпителиоцитов канальцев нефронов и собирательных трубок, свидетельствовавшими о структурно-функциональной перестройке ЭПР, нарушении нормального течения процессов конформационных изменений клеточных протеинов со срывом адаптации и развитием ЭПР-стресса. Данный факт объясняет снижение общей биосинтетической активности эпителиоцитов и показанные нами ранее нарушения экспрессии белков-ингибиторов кристаллизации [5].

Интенсивность развития литогенных процессов тесным образом связана со степенью пресыщения мочи солями. Применение цитрата натрия в качестве хелатирующего средства проявлялось ослаблением интенсивности литогенеза: в тканях почки обнаруживалось значительно меньшее содержание мелких депозитов кальция. Следует обратить внимание, что, несмотря на 6-недельное моделирование процессов камнеобразования, выраженность ультраструктурных изменений эпителия канальцев нефронов и собирательных трубок была умеренной, а их биосинтетическая активность статистически значимо не различалась от показателей здоровых животных. Наблюдавшееся в этих условиях усиление экспрессии шаперона GRP78 носило, вероятно, компенсаторный характер и являлось проявлением активации компенсаторной ветви ЭПР-стресса в условиях замедления развития и снижения интенсивности литогенных процессов, что обусловливало меньшие морфологические изменения органа.

На ранних сроках развития литогенных процессов еще до формирования клинически значимых крупных мочевых камней, локализованных в чашечках и лоханках, развиваются стереотипные гистотопографические и ультраструктурные изменения эпителия канальцев нефронов и собирательных трубок, способствующие прогрессированию процессов камнеобразования, нарушению клеточного гомеостаза с активацией стресса эндоплазматического ретикулума, нарушением синтеза или посттрансляционными изменениями белков-модуляторов литогенеза.

Выраженность морфофункциональных изменений тканевых элементов почки связана с интенсивностью процессов литогенеза: применение цитрата натрия в качестве хелатирующего средства снижает интенсивность этих процессов, способствует усилению синтеза шаперона GRP78, что обусловливает активацию компенсаторной ветви стресса эндоплазматического ретикулума, опосредует снижение повреждения эпителиальной выстилки канальцев нефронов и собирательных трубок и их ультраструктурные изменения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Г.М., А.В.Л., П.М.Л.

Сбор и обработка материала: Ю.Г.М.

Статистическая обработка: Ю.Г.М.

Написание текста: Ю.Г.М., А.В.Л., П.М.Л.

Редактирование: А.В.Л., П.М.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.