По данным классификации Всемирной организации здравоохранения, глиальные опухоли мозга человека являются самыми распространенными опухолями центральной нервной системы (ЦНС) зрелого и детского возраста [1]. Среди них гемистоцитарная астроцитома относится к гистологическому варианту диффузных астроцитом и составляет 10—15% всех астроцитом мозга. Олигодендроглиома составляет 5% всех первичных опухолей головного мозга и относится к глиомам с низким потенциалом злокачественности. Глиобластома является наиболее агрессивной глиомой, составляя около 50% всех астроцитом мозга. При этом различают первичную (чаще) и вторичную глиобластому (как результат малигнизации диффузной или анапластической астроцитомы).

По современным данным, патогенез глиальных опухолей ЦНС может быть связан с нарушением межклеточных взаимодействий посредством щелевых контактов (ЩК, нексусов) [2, 3]. При этом ЩК занимают особое место среди различных типов межклеточных соединений и являются ключевым структурно-функциональным фактором поддержания метаболического гомеостаза в органах и тканях [4, 5]. Они представляют собой гексаметрические мембранные поры, сформированные белками-коннексинами, которые напрямую соединяют цитоплазмы соседних клеток [6]. Таким образом, ЩК обеспечивают оптимальный путь прямого обмена биологически активными молекулами между цитоплазмами соседних клеток, в том числе сигнальными молекулами, влияющими на клеточную пролиферацию, дифференцировку и клеточную гибель [7].

Несмотря на возрастающий интерес к изучению ЩК и противоречивые данные об их сохранности при развитии глиальных опухолей мозга человека [8, 9], ультраструктурная идентификация нексусов при больших увеличениях в глиомах различной степени малигнизации ранее никем не проводилась.

Цель работы — электронно-микроскопическое исследование межклеточной сообщаемости в образцах гемистоцитарной астроцитомы (Grade II), олигодендроглиомы (Grade II) и глиобластомы (Grade IV).

Материалом для исследований служили фрагменты глиальных опухолей головного мозга человека, локализованных преимущественно в лобных долях, резецированные оперативным путем. Опухоли различались по степени злокачественности и включали гемистоцитарные астроцитомы (Grade II, n=2), олигодендроглиомы (Grade II, n=2), глиобластомы (Grade IV, n=3). Исследование одобрено этическим комитетом МБУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи» Ростова-на-Дону.

Фрагменты ткани опухоли, резецированные оперативным путем, фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида («Aurion», США) на фосфатном буфере. После 24-часовой фиксации ткань постфиксировали в течение 1,5 ч в 1% растворе OsO₄, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в смолу EPON-812. Ультратонкие срезы толщиной 50 нм получали с помощью ультрамикротома (Ultraсut-E, «Leiсa», Германия) и алмазного ножа ultra 45° («Diatome», Швейцария), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом Jem 1011 («Jeol», Япония). Морфометрический анализ проводили с помощью лицензионной программы Digital Micrograph («Gatan», США).

При увеличении 10 000 гемистоцитарная астроцитома представлена фибриллярными опухолевыми астроцитами с объемной угловатой цитоплазмой гемистоцитами. Гемистоциты расположены рыхло и разделены широкими межклеточными пространствами, однако в некоторых участках плотно прилегают друг к другу. Клетки содержат атипичные ядра с маргинированным хроматином и массивные пучки глиофибрилл в цитоплазме, которые при диагностической иммуногистохимии дают положительное окрашивание на GFAP (рис. 1). Некоторые ветвящиеся клеточные отростки также заполнены глиофибриллами. При последовательном просмотре полей зрения для поиска специализированных межклеточных соединений на фоне полного отсутствия химических синапсов в гемистоцитарной астроцитоме идентифицируются ЩК, сформированные тонкими отростками, имеющими ультраструктуру астроглиальных (рис. 2, а, б). ЩК выявляются благодаря специфической ультраструктуре: две контактирующие плазматические мембраны, формирующие узкую, прямую зону нексус с электронно-плотной щелью шириной не более 2—3 нм. Обнаруженные Щ.К. в опухоли локализованы между не содержащими глиофибриллы отростками астроцитов. При этом в окружающем контакты нейропиле глиофибриллы имеются в большом количестве (рис. 3). Помимо одиночных щелевых контактов в одном поле зрения встречаются несколько ЩК, бляшки которых попадают в плоскость среза при повороте гониометра на ±15° (см. рис. 3). Длина бляшек всех обнаруженных ЩК в образцах гемистоцитарной астроцитомы не превышает 0,1 мкм.

При исследовании ультраструктуры олигодендроглиомы визуализируются плотно расположенные мономорфные опухолевые клетки, между которыми находятся компактно упакованные тонкие клеточные отростки. Ядра опухолевых клеток незначительно варьируют в размерах и форме. Сами клетки содержат клеточные органеллы — мелкие овальные везикулы, единичные рибосомы, полисомы, цистерны гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, пластинчатые комплексы. Отдельно следует отметить нетипичные изменения ультраструктуры митохондрий: они увеличены в размерах, выявляются деформация крист митохондрий и их преобразование в тубулоподобные вытянутые электронно-плотные структуры (рис. 4, а). В нейропиле опухоли располагаются химические синапсы: пре- и постсинаптические отростки, активные зоны, везикулы. Вокруг аксошипиковых и аксодендритических синапсов наблюдаются сохраненные элементы астроглиальных отростков, однако при этом глиальные ЩК не обнаружены (см. рис. 4, б).

При ультраструктурном исследовании клетки глиобластомы расположены очень рыхло, их цитоплазма сравнительно бедна органеллами, глиофибрилл немного, нередко обнаруживаются лизосомы, а также единичные нейроэндокринные гранулы. Для опухолевых клеток характерны выраженная изрезанность контуров ядер, отшнуровка фрагментов кариоплазмы, присутствие внутриядерных включений и нескольких ядрышек. Нейропиль опухоли представлен широкими межклеточными пространствами с немногочисленными миелинизированными и немиелинизированными отростками (рис. 5). По нашим наблюдениям, основной тип межклеточных соединений в глиобластомах представлен десмосомоподобными контактами между опухолевыми клетками или между сомой и отростками клеток (рис. 6, г, д). Вместе с тем обнаружены и типичные ЩК между тончайшими отростками опухолевых клеток (см. рис. 6, а). Для демонстрации характерной ультраструктуры выявленных ЩК, как правило, необходимо подбирать оптимальный наклон объектодержателя с помощью гониометра (от 15° до –15°). Следует отметить, что особенностью ультраструктуры глиобластом являются заметное искривление и деформация зоны нексуса (см. рис. 6, б, в).

Ультраструктурная идентификация ЩК в глиальных опухолях человека ранее никем не проводилась. Судя по полученным данным, для гемистоцитарной астроцитомы как астроглиальной опухоли низкого грейда характерно сохранение межклеточных коммуникаций посредством Щ.К. Следует отметить, что все обнаруженные ЩК, представленные небольшими по длине зонами нексуса, выявлялись только между отростками астроцитов без выраженной фибриллярности, характерной для опухолевых клеток. В астроцитоме высокой степени злокачественности, по нашим наблюдениям, происходит примитивизация межклеточных контактов, поскольку характерные для глиальных клеток соединения в значительной степени заменяются десмосомоподобными контактами. При этом в глиобластоме обнаружены и единичные типичные ЩК, имеющие заметное искривление и деформацию зоны нексуса. Присутствие функциональных ЩК в образцах опухолей астроглиального происхождения низких и высоких грейдов может иметь как положительное, так и отрицательное значение для процессов малигнизации. С одной стороны, по современным данным, редукция количества ЩК способствует ускорению миграции опухолевых клеток в окружающую паренхиму [10], с другой — именно наличие таких контактов между сложно переплетенными отростками опухолевых клеток позволяет им создавать устойчивую самоподдерживающуюся сеть, способствующую прогрессированию опухоли и обеспечивающую сопротивление терапевтическому воздействию [11]. Очевидное проонкогенное значение имеют только ЩК, образуемые между малигнизированными клетками и нормальными астроцитами [12, 13].

В образцах олигодендроглиом ЩК с типичной ультраструктурой обнаружены не были, что может являться ценным диагностическим критерием и важной характеристикой данной опухоли наравне с сохранением аксошипиковых и аксодендритических химических синапсов [14]. Нарушение межклеточной сообщаемости посредством ЩК в олигодендроглиоме, по-видимому, связано с вытеснением астроцитов и их контактов в процессе роста опухоли, а также с редукцией ЩК между олигодендроцитами. Вероятно, в олигодендроглиоме, несмотря на сохранение химических контактов, отсутствие ЩК приводит к нарушению таких процессов, как пространственная буферизация для регуляции внеклеточной концентрации калия и других ионов, что может отражаться на активности нейронных сетей в окружающей ткани.

Проведенное электронно-микроскопическое исследование показало присутствие межклеточных ЩК с некоторыми ультраструктурными отличиями в образцах опухолей астроглиального происхождения низких и высоких грейдов. По современным данным, ЩК в астроцитомах способны создавать устойчивую самоподдерживающуюся сеть, способствующую прогрессированию опухоли и обеспечивающую сопротивление терапевтическому воздействию. В то же время заметная редукция количества ЩК, наиболее выраженная в образце олигодендроглиомы, может способствовать ускорению миграции опухолевых клеток в окружающую паренхиму. Безусловно, изучение ЩК должно быть продолжено на большей по численности группе глиальных опухолей для подтверждения выявленных в настоящей работе особенностей межклеточной коммуникации.

Работа выполнена при поддержке внутреннего гранта Южного федерального университета № 213.01−07−2014/05 ПЧВГ и гранта РФФИ № 15−04−03035.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.Ю.К., А.Э.М.

Сбор и обработка материала: А.Ф.С., Д.В.К., А.К.Л.

Статистическая обработка данных: А.К.Л., Е.Ю.К.

Написание текста: Е.Ю.К.

Редактирование: Е.Ю.К., А.Э.М.

Конфликт интересов отсутствует.