Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Полякова В.О.

НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Осколкова С.А.

ФГБНУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского», Москва, Россия

Абрамян А.В.

ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского», Москва, Россия

Иванова А.Г.

отделение патологоанатомическое I

Крылова Ю.С.

Гавриленко А.В.

ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского», отделение хирургии сосудов, Москва, Россия; кафедра госпитальной хирургии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия

Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в стенке внутренней сонной артерии при патологической извитости

Журнал: Архив патологии. 2016;78(3): 26-31

Просмотров : 71

Загрузок : 3

Как цитировать

Пальцева Е. М., Полякова В. О., Осколкова С. А., Абрамян А. В., Иванова А. Г., Крылова Ю. С., Гавриленко А. В. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в стенке внутренней сонной артерии при патологической извитости. Архив патологии. 2016;78(3):26-31. https://doi.org/10.17116/patol201678326-31

Авторы:

Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Все авторы (7)

Изучение сосудистых заболеваний головного мозга представляет одну из наиболее актуальных проблем современной медицины. По распространенности патологическая извитость внутренних сонных артерий (ПИ ВСА) уступает лишь атеросклеротическому поражению как причине нарушения мозгового кровообращения у взрослых [1]. Большая распространенность этой патологии у лиц трудоспособного возраста определяет высокую социальную значимость проблемы. По данным разных исследователей, большинство лиц с ПИ ВСА (65%) моложе 60 лет.

Варианты изменения длины и формы ВСА впервые описаны как случайные находки при аутопсии еще в 1741 г. Джованни Морганьи, однако патологическая значимость ПИ ВСА доказана лишь во второй половине XX века [2, 3]. В настоящее время наиболее широко используется классификация патологических форм ВСА, разработанная J. Weibel и W. Fields, в соответствии с которой выделяются три типа деформации: извитость (tortuosity), петлеобразование (coiling) и перегиб артерии (kinking) [4, 5]. На сегодняшний день основным и наиболее часто используемым показателем гемодинамической значимости ПИ ВСА является регистрируемая максимальная линейная скорость кровотока (ЛСКmax) в фокусе деформации более 120 см/с. К критериям гемодинамической значимости деформации также относят наличие турбулентного кровотока в просвете ВСА и повышение линейной скорости кровотока в зоне деформации по сравнению с интактным отделом (ЛСКпрокс) более чем в 2,5 раза (ЛСКmax/ЛСКпрокс) [6].

В основе возникновения конфигурационных аномалий лежит изменение гистологической структуры ВСА. Извитость и перегиб артерии развиваются в результате атеросклероза и фиброзно-мышечной дисплазии стенки артерии, в то время как петлеобразование представляет собой врожденную деформацию [7]. Фиброзно-мышечная дисплазия — невоспалительное заболевание артерий мелкого и среднего калибра, основные изменения при котором локализуются в медии и интиме [8, 9]. Ведущими морфологическими признаками фиброзно-мышечной дисплазии являются нарушение формирования эластических волокон и их фрагментация; кроме того, в медиальной оболочке выявляются разрастание фиброзной соединительной ткани, чаще всего под интимой, дистрофия коллагеновых волокон и гладкомышечных клеток [10—13]. Любое изменение структуры внеклеточного матрикса (ВКМ) означает нарушение устойчивого баланса между интенсивностью синтеза белков и их распада. Эластин, деградация которого является основным гистологическим изменением при патологической извитости, разрушается матриксными металлопротеиназами 2 и 9 (ММП-2, ММП-9).

Известно, что ММП-2 и ММП-9 играют значительную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Так, в формировании аневризмы аорты ведущую роль играет потеря эластина и коллагена, причиной чего служит повышение продукции различных типов протеаз, в том числе ММП-1, 2 и 9 [14, 15]. При этом экспрессия тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИМП-1 и ТИМП-2) понижена, что приводит к разрушению компонентов ВКМ стенки аневризмы [16, 17]. Необходимым условием нормального протекания физиологических процессов является поддержание равновесия между активностью ММП и их ингибиторов. Несмотря на интерес к изучению значения компонентов системы ММП/ТИМП в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, остается совершенно неизученной роль ММП и их ингибиторов в патогенезе ПИ ВСА.

Целью настоящего исследования явилось исследование экспрессии ММП-2, ММП-9 и их ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2 в стенке внутренней сонной артерии при ее патологической извитости методами иммуногистохимии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Материал и методы

На основании морфологического исследования образцов артерий пациентов, получивших хирургическое лечение по поводу ПИ ВСА, был отобран материал с фиброзно-мышечной дисплазией и образцы с сочетанным поражением (атеросклерозом), в которых имелись достаточные для оценки результатов участки дисплазии (n=32; мужчин — 6, женщин — 26, средний возраст 57,06±9,45 года). Контрольную группу составили 11 образцов внутренних грудных артерий (мужчин — 7, женщин — 4, средний возраст пациентов 59,27±8,27 года), полученных при маммарокоронарном шунтировании. Для анализа результатов пациенты были поделены на группы в зависимости от возраста: молодой возраст 25—44 года, средний — 45—59 лет и пожилой возраст — 60—75 лет.

Полученный при операциях материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, затем осуществляли гистологическую проводку и заливали в парафин. Для гистологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также использовали комбинированную окраску фукселином и пикрофуксином.

Депарафинирование и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica»). Использовали следующие первичные антитела: к ММП-2 (клон 6E3F8, «Abcam», разведение 1:200), ММП-9 (клон 5G3, «Abcam», разведение 1:200), ТИМП-1 (клон VT1, «Dako», разведение 1:100) и ТИМП-2 (клон 3A4, «Abcam», разведение 1:50). Срезы докрашивали гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии.

Оценивали экспрессию ММП-2 и ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в средней оболочке артерий, которая выявлялась в гладкомышечных клетках и внеклеточном матриксе. Результаты ИГХ-реакции определяли полуколичественным методом: (–) — отсутствие экспрессии, (+) — слабая, (++) — умеренная, (+++) — выраженная интенсивность иммунопероксидазной реакции. Для анализа данных типы экспрессии были объединены в 2 группы: низкая (–, +) и высокая (++, +++) экспрессия.

Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Исследование проводили на тонких депарафинизированных и дегидратированных срезах (2—4 мкм) с парафиновых блоков. Температурную демаскировку антигенов осуществляли с помощью 0,01 М цитратного буфера, рН 6,0, под давлением. Для промывки использовали фосфатно-солевой буфер с твином-20. Срезы инкубировали в течение 30 мин с блокирующей сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первые первичные антитела к ММП-9 (клон 439, «Novocastra», разведение 1:80) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали alexa fluor 647, «Abcam». После дополнительной отмывки образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с вторыми первичными антителами к ТИМП-1 (клон VT1, «Dako», разведение 1:100). В качестве вторичных антител использовали alexa fluor 488, «Abcam». После отмывки срезы докрашивали DAPI, appliChem. Все образцы заключали в монтирующую среду DACO. Результат: первое антитело — красная флюоресценция; второе антитело — зеленая флюоресценция; двойное окрашивание — голубая флюоресценция; контрастированное ядро — синяя флюоресценция. Исследование образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus 1100. Для изучения объектов получали спектры флюоресценции и определяли относительную площадь экспрессии в процентах для искомых антигенов. Флюоресценцию с определенными спектральными характеристиками регистрировали только в плоскости (2D).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программного обеспечения SPSS Statistics 17.0 для Windows. Данные, полученные в ходе исследования, представлены в тексте работы как средняя (М) ± стандартное отклонение (σ). Статистическую обработку результатов независимых выборок осуществляли методом непараметрической статистики (точный метод Фишера и критерий χ2). Различия расценивали как статистически значимые при достижении уровня статистической значимости (р) менее чем 0,05.

Результаты и обсуждение

Гистологическое исследование ВСА с фиброзно-мышечной дисплазией выявило нарушение структуры средней оболочки с фрагментацией эластических волокон. Отмечалось беспорядочное расположение коллагеновых волокон, местами — формирование фиброзных разрастаний. Интима артерий утолщена, в отдельных участках обнаружена деструкция внутренней эластической мембраны.

ИГХ-исследование ММП-2 не выявило статистически значимой разницы между группами, однако среди пациентов с ПИ ВСА чаще, чем в контрольной группе, встречались больные с высоким содержанием данного маркера в средней оболочке артерий (87 и 63,5% соответственно; р>0,05) (рис. 1, а). Сопоставление экспрессии ММП-9 показало, что при ПИ ВСА выявлена высокая экспрессия в 84,5%, низкая в 15,5% случаев, при этом в группе сравнения во всех образцах отмечено высокое содержание данной ММП (см. рис. 1, б). Однако различия не достигли статистической значимости (р>0,05) (табл. 1).

Таблица 1. Экспрессия ММП-2 и 9 и ТИМП-1 и 2 при патологической извитости внутренних сонных артерий и в контрольной группе Примечание. * — p<0,05.

Рис. 1. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов при патологической извитости внутренней сонной артерии и в контрольной группе. а — высокое содержание ММП-2 при патологической извитости внутренней сонной артерии; б — высокое содержание ММП-9 при патологической извитости внутренней сонной артерии; в — выраженная экспрессия ТИМП-1 в медии внутренней грудной артерии пациента из контрольной группы; г — высокая экспрессия ТИМП-2 при патологической извитости внутренней сонной артерии. а—г — иммуногистохимическая окраска. ×200.

Исследование ТИМП-1 в медии артерий показало статистически достоверное различие между группами: при ПИ ВСА преобладала его слабая экспрессия (84% случаев), а в группе сравнения — высокая (82% случаев; р<0,001) (см. рис. 1, в). Содержание ТИМП-2 было примерно одинаковым в обеих группах: в большинстве случаев отмечалась высокая экспрессия (78% при патологической извитости и 73% в контрольной группе; р>0,05) (см. табл. 1, рис. 1, г).

Поиск корреляций экспрессии каждого из четырех маркеров с полом и возрастом ни при ПИ ВСА, ни в контрольной группе зависимостей не выявил (р>0,05), что свидетельствует об отсутствии возрастных изменений содержания изучаемых маркеров в стенках артерий в данных группах.

Проанализировали соотношение изучаемых металлопротеиназ и их ингибиторов, для чего типы их экспрессии разделили на 4 группы:

1) низкая экспрессия ММП 2 или 9 при низкой экспрессии ТИМП-1 или 2 (например, ММП-2↓/ТИМП-1↓);

2) низкая экспрессия ММП 2 или 9 при повышенной экспрессии ТИМП-1 или 2 (например, ММП-9↓/ТИМП-1↑);

3) высокая экспрессия ММП-2 или 9 при слабой экспрессии ТИМП-1 или 2 (например, ММП-2↑/ ТИМП-1↓);

4) высокая экспрессия обоих маркеров (например, ММП-9↑/ ТИМП-2↑) (табл. 2, 3, 4, 5).

Таблица 2. Соотношение уровней экспрессии ММП-2 и ее ингибитора 1-го типа при патологической извитости внутренних сонных артерий по сравнению с контрольной группой Примечание. Здесь и в табл. 3—5: ↑ — повышенная экспрессия; ↓ — пониженная экспрессия; * — p<0,001.

Таблица 3. Соотношение уровней экспрессии ММП-9 и ее ингибитора 1-го типа при патологической извитости внутренних сонных артерий по сравнению с контрольной группой Примечание. * — p<0,05.

Таблица 4. Соотношение уровней экспрессии ММП-2 и ее ингибитора 2-го типа при патологической извитости внутренних сонных артерий по сравнению с контрольной группой

Таблица 5. Соотношение уровней экспрессии ММП-9 и ее ингибитора 2-го типа при патологической извитости внутренних сонных артерий по сравнению с контрольной группой

Сопоставление экспрессии ММП-2 и ТИМП-1 показало, что при ПИ ВСА преобладало высокое содержание металлопротеиназы при низком уровне ее ингибитора (78% пациентов), в то время как в контрольной группе чаще всего выявлялось одновременно выраженное накопление обоих маркеров (55% пациентов), несколько реже — слабая экспрессия ММП-2 при выраженной экспрессии ТИМП-2 (27% человек; см. табл. 2). Разница между группами статистически достоверна (р<0,001). Схожая картина отмечена и для соотношения ММП-9 и ТИМП-1: у 71% больных ПИ ВСА определялось высокое содержание металлопротеиназы при низком значении ее ингибитора, у 82% человек из контрольной группы выявлена синхронно выраженная экспрессия обоих белков (р<0,05; см. табл. 3).

Анализ соотношения содержания ММП-2 и ТИМП-2, так же как и ММП-9 и ТИМП-2, показал превалирование одновременно высокой экспрессии обоих белков и при ПИ ВСА, и в группе контроля (см. табл. 4, 5).

При исследовании методом конфокальной микроскопии уровней экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в контрольной группе получены следующие значения: экспрессия ММП-9 составила 9,1±0,64; ТИМП-1 — 8,4±0,57 (рис. 2, а). В группе ПИ ВСА выявлена экспрессия ММП-9 — 26±1,26; ТИМП-1 — 10,2±1,21 (см. рис. 2, б). При сравнении экспрессии MMП-9 и ТИМП-1 между группами выявлены достоверные различия (ММП-9; p<0,05; ТИМП-1; р<0,05). При этом отмечалась коэкспрессия данных маркеров в 80% случаев. В группе контроля наблюдался высокий уровень экспрессии ТИМП-1 и протеиназы, а в группе ПИ ВСА — высокий уровень протеиназы и низкий уровень ингибитора.

Рис. 2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов при патологической извитости внутренней сонной артерии и в контрольной группе. а — контроль, MMП-9 — красная флюоресценция 9,1%, TИMП-1 — зеленая флюоресценция 8,4%; б — патологическая извитость, MMП-9 — красная флюоресценция 26%, TИMП-1 — зеленая флюоресценция 10,2%. а, б — ×400.

Таким образом, в средней оболочке ВСА при патологической извитости отмечается увеличенное содержание металлопротеиназ, разрушающих эластин, ММП-2 и 9. При этом снижена экспрессия их ингибитора ТИМП-1 при неизменной экспрессии ТИМП-2. В то время как в неизмененных артериях, составивших контрольную группу, выявлялось одновременно выраженное накопление металлопротеиназ (ММП-2 и 9) и их ингибитора ТИМП-1, при развитии патологической извитости происходило нарушение баланса с превалированием металлопротеиназ над их ингибитором. Это приводит к усиленному расщеплению компонентов внеклеточного матрикса, в первую очередь эластина, что и является основным признаком фиброзно-мышечной дисплазии ВСА при их патологической извитости [11, 13, 18].

Исследований, посвященных изучению протеиназ и их ингибиторов при ПИ ВСА, мы не обнаружили, однако известна роль ММП и их ингибиторов в патогенезе различных заболеваний сосудов. Так, при развитии аневризм аорты гладкомышечные клетки средней оболочки продуцируют повышенное количество ММП-1, 2 и 9 [14, 15]. Вместе с тем, как показали результаты работ W. Wilson, E. Schwalbe (2005), а также C. Lipp и соавт. (2012), уровень ингибиторов металлопротеиназ ТИМП-1 и ТИМП-2 снижен в аневризмах брюшного отдела аорты по сравнению с нормальной аортой, что приводит к деградации компонентов ВКМ [16, 17].

Заключение

В нашем исследовании впервые изучена экспрессия ММП 2 и 9 и их ингибиторов в средней оболочке внутренних сонных артерий при патологической извитости. Фрагментация эластических волокон обусловлена нарушением равновесия между ММП и их ингибиторами, а именно превалированием ММП-2 и 9 над их ингибитором ТИМП-1, что приводит к деградации компонентов внеклеточного матрикса, в первую очередь эластина. Таким образом, нарушение баланса между ММП и их ингибиторами является одним из патогенетических механизмов нарушения структуры стенки артерий при патологической извитости.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.М.П., А.В.Г.

Сбор и обработка материала: В.О.П., С.А.О., А.Г.И., Е.М.П., А.В.А.

Статистическая обработка: Ю.С.К.

Написание текста: Е.М.П., В.О.П., С.А.О.

Редактирование: Е.М.П.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail