В настоящее время патология является одной из наиболее динамически развивающихся медицинских специальностей. Развитие иммуногистохимии, а также внедрение в практику цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследования позволили добиться серьезных успехов в диагностике злокачественных новообразований и их последующем лечении. Патология, как и многие другие специальности в медицине, испытывает на себе влияние растущей необходимости в углублении субспециализации. Это во многом обусловлено стремлением к улучшению качества диагностики, в частности и процесса лечения в целом, что в свою очередь диктует необходимость более тесного сотрудничества патологов и практических врачей лечебного профиля, повышает требования к составлению патологоанатомического заключения. Кроме междисциплинарной консолидации, современные условия развития медицины расширяют возможности коммуникации среди патологов во всем мире. В этой связи в патологоанатомическую практику внедряются различные технологические усовершенствования, которые призваны оптимизировать работу врача. Одним из примеров подобного развития является появление сканирующих систем, позволяющих полностью оцифровать исследуемый микропрепарат.

С момента разработки первой автоматизированной системы оцифровки гистологического препарата высокого разрешения, предложенной V. Wetzel и J. Gilbertson в 1999 г., интерес к использованию подобных систем в патологии непрерывно рос [1]. На сегодняшний день большинство сканирующих систем устроено единым образом. Они состоят из системы освещения, оптики и системы фокусировки. Формирование готового изображения происходит по-разному, в зависимости от конкретного типа сканера (мозаичное сканирование, линейное сканирование, двухсенсорное сканирование, динамическая фокусировка). Во всех случаях получается полностью оцифрованное изображение сканируемого гистологического препарата, которое может быть исследовано на экране монитора [2]. Применяемое программное обеспечение позволяет приблизить процесс просмотра гистологического препарата к аналогичному просмотру на обычном световом микроскопе. Патолог может свободно изучать каждый отдельный участок препарата, используя при этом любое из стандартных увеличений (а также их промежуточные значения), включая те, для которых необходимо использование иммерсионного масла. Эта технология значительно превосходит ранее применявшиеся методы оцифровки гистологического препарата. Так, метод микрофотографирования позволяет получать изображение только одного поля зрения и только в одном увеличении.

Развитие специализированных патоморфологических центров приведет к необходимости создания методов быстрой и удобной доставки гистологических препаратов к специалисту-патологу. Эта задача может быть решена с помощью создания компьютерной сети для передачи оцифрованных гистологических препаратов [3].

Вместе с тем внедрение цифровых технологий в патологию сопряжено с рядом проблем, решение которых сегодня пока не найдено. Прежде всего высокая стоимость нынешних сканирующих аппаратов не позволяет сделать сканеры доступными для широкого использования. Существует проблема несовместимости между различными сканерами. Каждый из аппаратов сканирует в своем собственном формате, предлагая для их просмотра собственное программное обеспечение. Возможно, это не является критичным при индивидуальном использовании, однако создание сети по удаленному консультированию препаратов или какого-то сервиса для совместного разбора сложных случаев будет сопряжено со значительными трудностями. Сюда же можно отнести проблему хранения отсканированных препаратов. В среднем объем одного файла полностью отсканированного препарата составляет от 500 МБ до 1 Г.Б. Если отсканировать полностью весь случай, а не только репрезентативные препараты, то объем данных может составить уже около 10—15 Г.Б. Даже несмотря на развитие широкополосного интернета и жестких дисков высокой емкости, свободно оперировать такими массивами информации одновременно довольно затруднительно. Интересными представляются сведения сотрудников отделения патологии медицинского центра Университета Утрехта (Нидерланды), которые задались целью создать цифровой архив всех препаратов, изготовленных в течение двух лет. По данным авторов, сканируя каждую неделю около 2000 препаратов, объем которых составлял от 5 МБ до 3,9 ГБ, в конце изучаемого периода они получили архив из 150 000 препаратов и около 40 ТБ данных ежегодно [4].

По сравнению с лучевой диагностикой, где отказались от традиционного процесса проявления снимков, внедрение сканеров не избавит от необходимости изготовлять гистологические препараты. Более того, пока выглядит далекой от реализации идея отказа от традиционной световой микроскопии в пользу просмотра препарата на экране монитора. Это объясняется существующими представлениями об ограниченных возможностях цифровых методов по сравнению с привычным микроскопом, который с успехом применяется в патологии уже более 100 лет.

Кроме того, чтобы отказаться от обычного просмотра препаратов в пользу их исследования на экране монитора, необходимо разработать процедуру валидизации данного метода. Хотя ряд работ показывает, что точность диагностики при просмотре отсканированного и обычного микропрепарата сопоставима [5, 6].

В настоящее время сканирование микропрепаратов широко используется в основном с образовательной целью как удобный инструмент создания иллюстраций к статьям, атласам, книгам и прочее. Тем не менее появление сканеров высокого разрешения способствовало развитию программ, способных проводить анализ получаемого изображения.

Появление сканеров гистологических препаратов способствовало созданию программного обеспечения, в задачи которого входил анализ получаемого изображения сканируемого препарата. Следует учитывать, что основная цель создания разработки этих программ — повышение количества и точности информации, которую можно получить из исследуемого микропрепарата. Иными словами, программа призвана не заменить патолога, а помочь ему в тех ситуациях, когда человеческих возможностей недостаточно для получения максимума полезной информации или же процесс анализа слишком трудоемок. Одновременно это также и попытка объективизировать работу патолога и повысить воспроизводимость результатов исследования. Поэтому следует сразу отметить, что речь не идет о том, чтобы предложить программе отсканированный препарат, а в ответ получить заключение по этому препарату. Любая программа является вспомогательным инструментом, который патолог может использовать в своей работе.

Основной принцип работы данных программ заключается в последовательном применении ряда математических алгоритмов, которые структурируют исследуемое изображение исходя из цвета, структуры объектов или их сочетания. Поэтому основное применение данные программы получили в области иммуногистохимии, а также флюоресцентной и хромогенной in situ гибридизации (FISH), где ключевая роль отводится оценке наличия и интенсивности окраски.

Несмотря на то что большинство программ (Aperio’s Image Analysis Toolbox (Aperio Technologies, Leica Biosystems), inForm (PerkinElmer, Waltham, MA), а также Tissue Studio (Definiens, Carlsbad, CA, Definiens Developer), Visiopharm (Hoersholm, Denmark) или Matlab (MathWorks, Natick, MA)) используют схожие алгоритмы обработки изображения, они отличаются между собой по сложности работы с ними. Одни программы работают непосредственно «из коробки», т. е. просты в обращении и требуют минимальной степени подготовки пользователя. Однако это ограничивает их функциональные возможности и, как правило, они предназначены для определенных задач. Такие программы хорошо подходят для лабораторий, где рутинно выполняются определенные общепринятые исследования. Другие программы, наоборот, требуют хорошей подготовки пользователя, который может адаптировать возможности программы под конкретные научно-исследовательские задачи.

Основными этапами при анализе изображений являются выделение и отбор характерных признаков, уменьшение размерности и классификация. Не будем подробно останавливаться на технических аспектах функционирования программ, так как это является прерогативой программистов-разработчиков, нежели врача. Приведем лишь некоторые примеры, которые позволят в самых общих чертах понять, каким образом работают эти программы.

Одним из основных признаков, которые используются для анализа изображения, является цвет. С точки зрения программы цвет каждого пикселя изображения может быть закодирован с помощью дискретного набора цветов. Используется цветовая модель RGB, основными цветами которой являются красный, зеленый и синий. Наибольшее применение получила 8-битная цветовая схема, которая позволяет представить 256 цветов. В соответствии с этим цвет объекта является той информацией, которая может быть воспринята программой и становится доступной дальнейшему анализу.

Например, для обнаружения ядер клеток предложен метод ядерной сегментации, который позволяет на основании размера, формы и цвета определить ядра клеток в исследуемом образце. Следует отметить, что препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, трудны для программной обработки, так как они достаточно неоднородны и неконтрастны.

Выявленные ядра клеток могут стать основой для того, чтобы определять структуры, которые эти клетки образуют. Для этой цели используется теория графов. Граф — основной объект изучения математической теории графов, совокупность непустого множества вершин и наборов связей между вершинами (рис. 1).

В нашем случае вершинами являются ядра клеток, а соединяющие их линии — ребра графа. Получаемые таким образом фигуры могут анализироваться программой. Сочетание этих методов анализа позволяет выявлять интересующие структуры, например опухолевые комплексы.

По некоторым данным, в США ежегодно выполняется около 1 млн биопсий простаты, при этом рак простаты диагностируется только в 20% случаев [7]. С определенными оговорками можно сказать, что бо́льшую часть времени патолог тратит на просмотр доброкачественной ткани простаты, вместо того чтобы заниматься действительно сложными случаями. Этот тезис является достаточно дискуссионным, однако одним из научных направлений развития программ анализа препарата действительно является выявление на фоне нормальных структур и стромы опухолевых паттернов. В частности, предложено несколько алгоритмов, позволяющих автоматически обнаруживать в биоптатах простаты доброкачественные железы и опухолевые железы. Однако системе удавалось выявлять только паттерны, соответствующие 3 и 4 баллам по системе градации Глисона (рис. 2) [8]. Общий принцип программного выявления тех или иных структур основан на «обучении» программы патологом, т. е. врач несколько раз указывает программе на определенные структуры в препарате, которые он хочет найти в остальном препарате, например на опухолевый паттерн, нормальную железистую структуру и элемент стромы. После этого программа в соответствии с заданными параметрами осуществляет поиск.

Таким образом, базовыми возможностями всех крупных программных пакетов являются выявление и подсчет клеток (ядра или мембраны), экспрессирующих тот или иной антиген, при выполнении иммуногистохимического исследования. Определение плотности сосудов при использовании антител CD31 или фактора VIII, определение индекса пролиферативной и митотической активности при окраске антителами Ki-67 и PHH3 соответственно, оценка уровня экспрессии при использовании двух различных антител и двух систем детекции, выявление различных структур (площадь участков некроза, объем, занимаемый элементами опухоли от всего биоптата и др.).

Вначале мы упоминали о том, что автоматизированный анализ позволяет объективизировать работу патолога. Морфологическое заключение во многом основывается на субъективном восприятии исследуемого материала, и в качестве критериев заключения нередко выступают описательные характеристики, что отражается на воспроизводимости результатов исследований [9]. Широкое внедрение в практику оценки экспрессии различных маркеров и основанная на этих данных концепция персонифицированной медицины требуют от патолога максимальной точности и аккуратности при формулировании заключения. Так, для оценки экспрессии чаще используются субъективная 3-балльная система (0 — отсутствие экспрессии, +3 — выраженная экспрессия) либо полуколичественные методы. Недостаточная воспроизводимость результатов является серьезным препятствием для дальнейшего развития автоматизированного анализа в этой области. Необходимы стандартизация методов и критериев оценки результатов исследований и переход от полуколичественных методов оценки к количественным. Однако, с другой стороны, стандартизировать восприятие человеческого глаза невозможно. В этой связи определенные надежды связываются с развитием программного анализа, который может претендовать на некоторую объективность. Качество информации, которое можно получить с помощью программ, во многом зависит от преаналитического этапа — забора материала, времени тепловой и холодовой ишемии, вырезки, фиксации и проводки материала, методики окраски, микротомии и др. [10]. Несмотря на активное развитие высоких технологий, не все этапы преаналитической подготовки материала доступны для стандартизации [11].

Тем не менее Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами в США (FDA) выдало ряду крупных фирм разрешение 510 (k), позволяющее рекомендовать свои программы для использования в клинической практике [12]. Во всех случаях это касается исследования биомаркеров при раке молочной железы — определение уровня экспрессии HER2/neu, ER/PR, Ki-67 и p53. В большинстве других случаев производитель предупреждает о том, что использование программного обеспечения возможно только в рамках исследований.

Примером актуального использования программного заключения для постановки диагноза является оценка результатов экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона клетками рака молочной железы. В настоящее время приняты количественные и полуколичественные методы оценки уровня экспрессии, такие как HistoScore и PharmDx.

При оценке рецепторного статуса по шкале HistoScore определяется степень экспрессии (процент позитивных клеток) и ее интенсивность (показатель экспрессии в баллах). Экспрессия рецепторов к эстрогену оценивается по 3-балльной шкале (слабая, умеренная и выраженная). Показатель экспрессии (ПЭ) определяется как сумма произведений степени экспрессии на процент соответственно окрашенных клеток: ПЭ = (3∙А) + (2∙В) + (1∙С),

где, А — процент клеточных ядер, имеющих выраженную окраску; В — процент умеренно окрашенных ядер. Шкала варьирует от 0 до 300 баллов с градациями уровней, среди которых менее 50 баллов оценивается как отрицательный результат.

Также распространена оценка экспрессии по шкале PharmDx (Allred Score). По шкале PharmDx оцениваются интенсивность реакции и относительное количество позитивных клеток, которые суммируются в баллах (рис. 3).

В соответствии с этим существует ряд программных модулей, предназначенных для автоматизированного подсчета клеток и определения интенсивности окраски. Понятно, что аналогичные вычисления можно применять и для других антител, однако для них нет рекомендации FDA.

Аналогичные измерения соответственно можно проводить для оценки мембранной экспрессии рецепторов или для определения индекса пролиферативной активности при окраске с антителами Ki-67.

Отдельным направлением в развитии программного обеспечения стала работа с препаратами, окрашенными несколькими антителами. Множественная окраска повышает информативность препарата, позволяет экономить реагенты, а также эффективно использовать ограниченный объем материала. Множественные флюоресцентные красители широко применяются в FISH.

Цифровые системы анализа изображений дали возможность полностью отказаться от необходимости дифференцировки окрашивания человеческим глазом. Каждому из используемых красителей должна соответствовать определенная длина волны возбуждения, что позволяет дифференцировать сигналы. Кроме того, заложенный в систему анализа изображений алгоритм позволяет компенсировать перекрытие эмиссионного спектра, а также принимать сигнал из определенного диапазона длин волн. Автоматизированный анализ также дает возможность определить интенсивность сигнала, что позволяет исключить неспецифическое или фоновое окрашивание конечного изображения.

Как уже было отмечено ранее, автоматизированный анализ дает возможность количественной оценки сигнала. Заложенный программный алгоритм способен подсчитать количество кластеров сигнала, превышающего определенный уровень интенсивности, а также количество клеток разного типа и процент положительно окрашенных клеток.

Ключевую роль в дальнейшем распространении и внедрении в практику многоцветного окрашивания будет играть разработка программного обеспечения для получения и анализа цифрового изображения, так как возможности человеческого глаза в данном случае ограничены, и он способен воспринять и различить лишь ограниченное количество цветов. Со временем множественное окрашивание станет рутинным методом, однако для этого необходимо дальнейшее совершенствование не только программного и технического обеспечения, но и методики окрашивания. Тем не менее программа никогда не заменит врача, так как окончательное решение всегда остается за ним.

Необходимо отметить, что, начиная с микрофотографий, цифровая патология проделала большой путь в своем развитии. Сегодня в распоряжении патологов находятся цифровые сканирующие системы микропрепаратов высокого разрешения, разнообразное программное обеспечение для анализа получаемого изображения и коммуникационные технологии, позволяющие удаленно получить консультацию практически любого специалиста. Дальнейшее развитие персонифицированной медицины сделает компьютерные технологии неотъемлемой частью диагностического процесса в патоморфологии. Однако до этого предстоит решить множество проблем, связанных с внедрением автоматизированного анализа. Прежде всего это проблемы как оптимизации и валидизации применяемых методов анализа, так и стандартизации самих методов исследования, применяемых в настоящее время в патологической анатомии. Несмотря на это, возможности компьютерного анализа позволяют рассчитывать, что качество диагностического процесса выйдет на принципиально иной уровень. Так, важно подчеркнуть, что компьютерные технологии призваны помочь работе врача-патолога, ни в коем случае не отменяя его ключевой роли в лечебно-диагностическом процессе.

Статья публикуется в рамках выполнения проекта с Российским научным фондом № 14−15−01120.

Конфликт интересов отсутствует.