Фибриноген — это глобулин с молекулярной массой 350 000 D, являющийся растворимым плазменным гликопротеином и представленный двумя идентичными субъединицами; каждая из них содержит 3 пары полипептидных цепочек (Aα, Bβ, γ). Пространственная структура молекулы фибриногена состоит из центрального Е-домена и 2 периферических D-доменов [1]. Полипептидные α- и β-цепи формируют глобулярные структуры — фибринопептиды, А и В, которые закрывают комплементарные участки в фибриногене и не позволяют этой молекуле полимеризоваться [1]. Фибриноген превращается в фибрин под действием тромбина, который отщепляет от фибриногена фибринопептиды, А и В, составляющие лишь 3% его белковой массы. Затем происходит спонтанная полимеризация образовавшихся мономеров фибрина в сгустки, которые стабилизируются XIIIа фактором свертывающей системы крови в прочный полимер фибрин.

Известны различные методы определения уровня фибриногена [2]. В клинической практике широко распространено определение уровня фибриногена методом Клаусса, основанное на установлении времени образования сгустка при добавлении высокой концентрации тромбина к разбавленной в 10—20 раз плазме. Для выполнения теста используют коагулометры, при этом учитывают, что логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена [1].

Функциональную оценку полимеризации фибрина можно дать также с помощью тромбоэластографии (ТЭГ) или ротационной тромбоэластометрии (ROTEM) [3, 4]. В обоих этих методах максимальная амплитуда кривой, отражающая эластичность и прочность образовавшего сгустка Maximum Amplitude (MA) в ТЭГ или Maximum Clot Firmness (MCF) в ROTEM, определяется функциями тромбоцитов и фибриногена [5]. Подавление функции тромбоцитов с помощью цитохалазина D, являющегося ингибитором реорганизации цитоскелета в тесте FIBTEM, или антагониста рецепторов GPIIb/IIIa препарата абциксимаб (ReoPro) в тесте «Функциональный фибриноген» на ТЭГ, позволяет вычленить из МА «вклад» тромбоцитов и оценить величину FF [6—10]. Концентрация фибриногена в плазме коррелирует (r=0,9) с уровнем FF [9—12]. В тесте FIBTEM показатель MCF, равный 7 мм, ассоциируется с уровнем фибриногена 2 г/л, а MCF 6 мм — с 0,9 г/л [12].

В то же время в ряде случаев результаты измерения плазменной концентрации фибриногена и уровня FF могут разниться [9, 11]. Сопоставлены результаты определения концентрации фибриногена с применением метода Клаусса и теста FIBTEM у 36 больных, которым проведено хирургическое лечение. Несмотря на корреляцию между методами, при определении уровня фибриногена методом Клаусса ни в одном случае не выявлено показаний к коррекции гипофибриногенемии (концентрация фибриногена 1 г/л). Вместе с тем по данным теста FIBTEM у 44% больных такие показания обнаружены [11]. Даны несколько объяснений выявленному феномену: во-первых, образование сгустка нарушается раньше, чем происходит выраженное снижение плазменной концентрации фибриногена; во-вторых, концентрация фибриногена 1 г/л, возможно, является заниженной величиной для начала коррекции гипофибриногенемии; в-третьих, на определение уровня фибриногена могут влиять переливаемые во время операции растворы. При переливании коллоидных растворов нарушается процесс полимеризации фибрина, в результате чего уровень фибриногена в плазме, определенный методом Клаусса, может оказаться завышенным [13, 14]. При разбавлении гидроксиэтилкрахмалом образцов плазмы, полученных от здоровых волонтеров, выяснено, что дилюция плазмы на 30% приводит к завышению уровня фибриногена, определяемого фиброоптическим методом, на 50%, а при дилюции на 50% это завышение достигает уже 100% [13]. На ошибочное определение концентрации фибриногена большее влияние оказывает концентрация раствора гидроксиэтилкрахмала, чем размер его молекул [14]. Метод определения фибриногена по Клауссу чувствителен также к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации мономеров фибрина и могут быть причиной ложных низких результатов [1]. Поэтому в европейских руководствах по лечению коагулопатии при массивной травме рекомендуется принимать решение о коррекции гипофибриногенемии при снижении концентрации фибриногена плазмы ниже 1,5—2 г/л (уровень рекомендаций 1С) и ориентироваться не только на концентрацию фибриногена в плазме, но и на величину FF, определяемую по данным ТЭГ (уровень рекомендаций 2С) [15].

Еще один вариант подхода к определению уровня FF разработан В.С. Афончиковым [16], который предложил оценивать уровень фибриногена по величине МА ТЭГ, выполненной с обедненной тромбоцитами плазмой. Недостатком данного метода является то, что для получения обедненной тромбоцитами плазмы необходимо центрифугировать кровь в определенных режимах, т. е. требуется лабораторное оборудование, и тест не может быть выполнен у постели больного. Кроме того, полученная после центрифугирования обедненная тромбоцитами плазма никогда не является полностью свободной от тромбоцитов, а их количество в ней может варьировать. Следовательно, и максимальная амплитуда ТЭГ обедненной тромбоцитами плазмы будет варьировать и зависеть от количества оставшихся в ней тромбоцитов, неточно отражая уровень FF.

Цель исследования — разработать метод определения уровня активного фибриногена (АФ) с помощью ТЭГ, не подверженный влиянию количества тромбоцитов крови и гепаринотерапии, а также адаптированный для выполнения у постели больного.

В соответствии с поставленными задачами исследование состояло из двух этапов: 1-й этап — разработка нового реактива, который бы индуцировал образование фибрина из фибриногена, не активируя при этом тромбоциты; 2-й этап — сравнение полученных с помощью нового реактива результатов определения фибриногена в крови у больных с результатами известных методов — метода Клаусса и ТЭГ.

В качестве реактива, индуцирующего образование фибрина, выбран батроксобин — фермент из яда гремучей змеи Bothrops atrox, обитающей в Южной и Центральной Америке. Батроксобин — тромбиноподобная протеаза, вызывающая переход фибриногена в фибрин путем отщепления от фибриногена фибринопептида А, что отличает ее от действия тромбина, который, кроме фибринопептида А, отщепляет от фибриногена еще и фибринопептид В. Батроксобин не подавляется антитромбином III и гепарином, поэтому его можно использовать для оценки полимеризации мономеров фибрина в присутствии гепарина. Поскольку на определение концентрации АФ в цельной крови оказывает влияние возможная активация тромбоцитов, одной из задач исследования было получить тромбиноподобный фермент из яда гремучей змеи Bothrops atrox, который одновременно не активировал бы тромбоциты.

С этой целью подобраны условия хроматографии, которые заключались в следующем: 50 мг яда растворяли в буферном растворе состава 50 мМ трис-HCl, рН 7,4 и наносили на колонну 1,6×15 см с анионообменным сорбентом DEAE-Sepharose Fast Flow («Sigma-Aldrich», Германия). Сорбент промывали стартовым буфером и затем связанный с сорбентом белок элюировали градиентом ионной силы натрия хлорида (градиент ионной силы от 0 до 100 мМ). В выходящих фракциях (по 5 мл) автоматически записывалась концентрация белка, а также определяли время свертывания с раствором фибриногена: чем короче было время свертывания, тем выше активность тромбиноподобного фермента в выходящих с колонны фракциях. Фракции фермента собирали отдельно, стабилизировали, добавляя бычий сывороточный альбумин до концентрации 5 мг/мл, разливали по флаконам и лиофилизировали. Исследовали влияние обеих фракций батрокобсина на тромбоциты в тесте ТЭГ. Для этого из пробы цельной гепаринизированной крови путем центрифугирования получали обедненную и обогащенную тромбоцитами плазму, согласно общепринятым методам [17]. С полученными образцами обедненной тромбоцитами плазмы и обогащенной тромбоцитами плазмы выполняли ТЭГ с каждой из фракций батроксобина на тромбоэластографе TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США). Для этого к 340 мкл каждого образца плазмы, полученной из гепаринизированной крови, добавляли по 10 мкл раствора батроксобина активностью 5 МЕ/мл. Оценивали М.А. тромбоэластограммы.

Кровь у больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette (SARSTEDT, Германия) с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата натрия, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий-гепарином (концентрация гепарина 10—30 ед/мл крови).

Концентрацию фибриногена в плазме цитратной крови определяли методом Клаусса на коагулометре Sysmex CA-620 («Sysmex», Япония) c помощью реактивов компании «Siemens» (Германия).

Уровень FF исследовали на TEG 5000. В кювету для ТЭГ вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реактивом Functional Fibrinogen Reagent («Haemonetics Corporation», США). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли ТЭГ. По окончании теста определяли МА для FF (MА_FF).

ТЭГ цельной гепаринизированной крови выполняли на TEG 5000. Для этого 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую предварительно добавляли 10 мкл раствора батроксобина, полученного описанным выше способом, с активностью 5 МЕ/мл. Определяли МА_{БАТРОКС} на ТЭГ.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных компьютерных программ Microsoft Excel 2007, BioStat. Коэффициенты корреляции рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа с применением метода наименьших квадратов. Систематическую ошибку (bias) рассчитывали как среднее различий между двумя методами в определении показателя. Пределы соглашения (Limits of agreement — LOA) между двумя методами для 95% доверительного интервала (ДИ) рассчитывали как bias ± 2 стандартных отклонения. Сравнение систематической ошибки и LOA между двумя методами проводили с помощью метода Блэнда—Альтмана [18]. Процентная ошибка более 30% по методу Critchley и Critchley [19] свидетельствует, что даже несмотря на корреляцию, оба метода определяют не одинаковый параметр.

В результате хроматографической очистки тромбиноподобная активность батроксобина распределялась по двум фракциям; 1-я фракция элюировалась с колонны при низкой концентрации соли, а 2-я — при более высокой концентрации (рис. 1).

Исследовано в тесте ТЭГ влияние каждой из фракций на функцию тромбоцитов. Для этого выполнили ТЭГ с обедненной и обогащенной тромбоцитами плазмой для каждой из фракций. Установлено, что 1-я фракция батроксобина не оказывала существенного влияния на максимальную амплитуду ТЭГ в образцах обедненной и обогащенной тромбоцитами плазмы (рис. 2).

ТЭГ со второй фракцией батроксобина характеризовалась значительно большей МА в обогащенной тромбоцитами плазме, чем в обедненной тромбоцитами плазме (рис. 3),

Исследованы 30 образцов крови, полученных у 17 больных. Концентрация фибриногена в плазме цитратной крови, определенная методом Клаусса, варьировала от 0,5 до 8,7 г/л. Величина МА_{БАТРОКС} на ТЭГ в пробе с батроксобином и гепаринизированной кровью колебалась в пределах от 2,3 до 62,5 мм и коррелировала с концентрацией фибриногена (r=0,83; р<0,001) (рис. 4),

АФ _{БАТРОКС} = 0,1153 × МА_{БАТРОКС} + 0,5903,

где АФ_{БАТРОКС} — это расчетная концентрация АФ (в г/л) в тесте с батроксобином, МА_{БАТРОКС} — МА на ТЭГ с гепаринизированной кровью и батроксобином (в мм); 0,1153 и 0,5903 — коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).

Концентрация АФ в пробе с батроксобином, рассчитанная согласно уравнению, колебалась от 0,8 до 7,8 г/л, т. е. значения были близки к концентрации фибриногена по Клауссу.

Исследованы 30 образцов крови, полученных у 17 больных с онкогематологическими заболеваниями. Величина МА_{БАТРОКС} колебалась от 2,3 до 62,5 мм; величина МА_FF — от 7,6 до 54,5 мм. На рис. 5 показана

Коэффициент корреляции между МА_FF и МА_{БАТРОКС} составил 0,88 (р<0,001). При сравнении по методу Блэнда—Альтмана оба показателя также соответствовали друг другу (рис. 6).

Клинический пример 1. Сравнение концентрации фибриногена, определенной методом Клаусса, с концентрациями FF и АФ, определенными двумя методами с помощью ТЭГ у больной с гипофибриногенемией до и после коррекции

Больная З., 29 лет, госпитализирована в связи с впервые выявленным острым промиелоцитарным лейкозом. У больной имелся выраженный геморрагический синдром в виде гематом после инъекций, спонтанных гематом на коже груди, нижних конечностей. При поступлении плазменная концентрация фибриногена, определенная методом Клаусса, составила 1,1 г/л. Выполнен тест для определения уровня FF на TEG 5000 с реактивом Functional Fibrinogen Reagent с цитратной кровью. MA_FF составила 13,5 мм, что соответствовало уровню FF (FLEV) 2,5 г/л (рис. 7).

Одновременно выполняли ТЭГ c батроксобином и гепаринизированной кровью. МА_{БАТРОКС} составила 3,6 мм (рис. 8),

Больной выполнена коррекция гипофибриногенемии трансфузиями 40 доз криопреципитата. При повторном исследовании крови плазменная концентрация фибриногена, определенная методом Клаусса, составила 3,7 г/л. При выполнении пробы на FF с реактивом Functional Fibrinogen Reagent, как описано выше, MA_FF составила 28,8 мм, что соответствовала расчетному уровню FF (FLEV) 5,3 г/л (рис. 9).

Клинический пример 2. Сравнение концентрации фибриногена, определенной методом Клаусса с концентрациями FF и АФ, определенными двумя методами с помощью ТЭГ у больной с тромбоцитозом. Больная А., 21 год, установлена талассемия. В 2013 г. выполнена спленэктомия. С 2013 г. в клиническом анализе крови у больной выявляется тромбоцитоз. На момент исследования концентрация тромбоцитов в периферической крови составила 1333·10⁹/л, плазменная концентрация фибриногена по методу Клаусса — 1,1 г/л. По результатам ТЭГ с реактивом Functional Fibrinogen Reagent для исследования уровня FF MA_FF составила 34 мм, что соответствовало расчетному уровню FF (FLEV) 6,3 г/л (рис. 11).

Батроксобин издавна используют для исследования фибриногена в клоттинговом тесте «батроксобиновое (рептилазное) время». Это тест, в котором определяют время образования фибринового сгустка в цитратной плазме под действием батроксобина. Батроксобиновое время уменьшается при гиперфибриногенемии и удлиняется при снижении содержания фибриногена в крови и некоторых дисфибриногенемиях, а также при гиперфибринолизе и наличии в кровотоке большого количества продуктов деградации фибрина, затрудняющих полимеризацию мономеров фибрина [1]. При исследовании батроксобинового времени применяют плазму крови, поэтому количество тромбоцитов крови не оказывает существенного влияния на результаты теста. В отличие от теста на батроксобиновое время в ТЭГ с батроксобином мы использовали цельную кровь и оценивали величину МА, на которую влияют функции как фибриногена, так и тромбоцитов крови. В этих условиях принципиальным было выделить фракцию батроксобина, которая стимулировала бы образование из фибриногена фибрина, не влияя при этом на функцию тромбоцитов. Нам удалось выделить фракцию батроксобина, не влияющую на функцию тромбоцитов.

В отличие от классического теста на FF, выполняемого с цитратной плазмой, тест с батроксобином выполняется с гепарином, который не позволяет активировать тромбоциты, с одной стороны, а с другой — на результаты теста не влияет наличие гепарина в крови у пациента; этот тест можно выполнять больным, уже получающим гепарин. Для того чтобы нейтрализовать гепарин, тест с реактивами Functional Fibrinogen Reagent рекомендуется выполнять с гепариназой, а в тесте FIBTEM гепариназа исходно присутствует в стандартном реактиве.

Как показали наши исследования, МА_{БАТРОКС} хорошо коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, а также с МА_FF, полученной с реактивом Functional Fibrinogen Reagent. В то же время известно, что FF, определенный с помощью ТЭГ, может завышать уровень фибриногена [20]. Возможной причиной завышения уровня фибриногена является то, что при этом методе не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты; это было показано при сравнении его с методом ТЭГ, при котором использовали другой ингибитор тромбоцитов. Причем это завышение тем выше, чем больше уровень тромбоцитов в крови. Поэтому предложена модификация теста FIBTEM или FIBTEM Plus [21]. В тесте FIBTEM Plus для лучшего подавления функции тромбоцитов наряду с цитохалазином D добавляется ингибитор тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa — препарат тирофибан.

В нашем исследовании наибольшие расхождения между плазменной концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, и уровнем FF, по данным ТЭГ, выявлены у больных с тромбоцитозом, что не является неожиданным. В случаях выраженного тромбоцитоза стандартная доза абциксимаба может не полностью ингибировать тромбоциты [21] и следовательно сохраняется их вклад в МА ТЭГ, поэтому ее величина будет завышенной. При определении уровня FF в гепаринизированной крови в тесте с батроксобином тромбоциты вообще не участвуют в формирования сгустка и МА, следовательно их количество в крови не влияет на определяемую концентрацию FF.

Максимальная амплитуда на тромбоэластограмме, выполненной с гепаринизированной кровью и добавлением батроксобина, коррелирует с плазменной концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, а также с максимальной амплитудой на тромбоэластограмме, выполненной с реактивом Functional Fibrinogen Reagent, для исследования уровня функционального фибриногена и отражает концентрацию активного фибриногена у больных с гипофибриногенемией и тромбоцитозом. Применение отечественных реагентов для определения активного фибриногена с помощью тромбоэластографии позволит широко использовать этот метод в России.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции: Галстян Геннадий Мартинович, доктор мед. наук, зав. отд. реанимации и интенсивной терапии ФГБУ НМИЦ гематологии МЗ РФ, 125167, Москва. E-mail: gengalst@gmail.com.