Противосудорожная активность впервые синтезированного анальгетика из класса гексаазаизовюрцитанов. (Экспериментальное исследование)

Несмотря на вековую историю фармакотерапии боли, существующий арсенал анальгетиков остается несовершенным. Ключевые недостатки, такие как целый ряд побочных эффектов нестероидных противовоспалительных препаратов (гастродуоденопатия, нефротоксичность, гепатотоксичность и гематотоксичность, кардиоваскулярные эффекты и т.д.), риск развития психической и физической зависимости опиоидов, потолок эффективности для многих обезболивающих лекарственных средств, диктуют необходимость поиска принципиально новых терапевтических стратегий и молекулярных структур [1]. Задачу снижения стоимости и ускорения процесса разработки новых лекарств в современной фармакологии в настоящее время решают с помощью методов виртуального скрининга. Доступные веб-инструменты не только позволяют разрабатывать биоактивные молекулы и осуществлять перепрофилирование лекарств, но и стимулируют генерацию новых идей и проверку гипотез, что в конечном счете вносит существенный вклад в создание принципиально новых веществ. Так, в результате применения компьютерного drug-design и технологий направленного химического синтеза была создана first-in-class-молекула на основе фармакофора — высокоэнергетического вещества 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (гексаазаизовюрцитана). Впервые синтезированное соединение было использовано в качестве фармацевтической субстанции для создания прототипа эффективного и малотоксичного анальгетика тиовюрцин (капсулы 120 мг). Комплексные исследования in silico и in vivo установили, что анальгетическое действие тиовюрцина реализуется за счет модуляции активности TRPA1- и TRPV1-рецепторов, а также потенциал-зависимых кальциевых каналов. Этот уникальный механизм действия обусловливает отсутствие у препарата как опиоидных (морфиноподобных) эффектов, так и характерных для нестероидных противовоспалительных препаратов побочных действий. Отсутствие эффекта в тестах с ареколиновым тремором в сочетании с подавлением триптофанового гиперкинеза позволяет заключить, что вещество ингибирует активацию серотонинергической системы, но лишено антимускариновых (м-холиноблокирующих) свойств [2, 3].

Изучение противосудорожных свойств у потенциального анальгетика является логичным и важным, поскольку противосудорожные препараты уже давно и успешно используются в лечении хронических болевых синдромов, особенно в терапии нейропатической боли, фибромиалгии, мигрени. Хронические болевые синдромы и эпилепсия имеют общие патофизиологические механизмы, включая центральную сенситизацию, нарушение баланса между возбуждающей (глутаматергической) и тормозной (ГАМКергической) системами, а также дисфункцию ионных каналов [4—7]. Модели судорог, индуцированных ГАМК-проконвульсантами (такими как коразол, тиосемикарбазид), различающимися по механизму действия, могут быть использованы для изучения как антиконвульсивных свойств анальгетика, так и участия ГАМКергической системы в реализации анальгезии [8].

Цель исследования — изучить антиконвульсивную активность впервые синтезированного анальгетика из класса гексаазаизовюрцитанов (тиовюрцина) на моделях судорог, вызванных введением коразола и тиосемикарбазида.

Эксперименты были выполнены на 108 мышах-самцах стока CD-1 (вес 28—32 г), конвенциональных, 1-й категории, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга ТНИМЦ РАН. Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены комиссией по биоэтике НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол JACUC №96092015) и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях; ГОСТ 33044—2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (введен в действие 01.08.2015).

Распределение на группы осуществляли рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела (±10%), в каждой группе было не менее 10 животных. Эвтаназию животных проводили в CO₂-камере.

Объект исследования — фармацевтическая субстанция тиовюрцин, представляет собой кристаллический порошок белого цвета без запаха. Содержит не менее 97,0% C₁₉H₂₀Br₂N₆O₅S (эмпирическая формула) в пересчете на сухое вещество. Тиовюрцин легко растворим в ацетоне, диметилсульфоксиде (ДМСО), твине-80, мало растворим в спирте 96%, практически нерастворим в воде, температура плавления 328—330°С. Характеристика тиовюрцина полностью подтверждена физико-химическими методами исследования: ИК-спектр, ν/см^–1, спектр ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1Н (ДМСО-d, δ, м.д.), спектр ЯМР С (ДМСО-d6, δ, м.д.). Молекулярная масса соединения (М.м.) 604,27.

Дозы 50, 100 и 200 мг/кг, внутрижелудочный путь введения выбраны на основании ранее проведенных экспериментов по исследованию анальгетической активности [2, 3]. В качестве растворителя для тиовюрцина использовали воду очищенную с добавлением 20 мкл твин-80 (полисорбат LAUROPAN T/80, Италия) на 1 мл воды. Животным негативного контроля вводили водно-твиновый раствор в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела. В качестве позитивного контроля использовали карбамазепин (Carbamazepine, Sigma, China) внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в объеме 0,2 мл воды очищенной на 20 г массы тела мыши [9, 10]. Противосудорожная активность исследовалась в тестах антагонизма с коразолом (пентилентетразол (ПТЗ), Sigma, Germany), тиосемикарбазидом (Sigma, Germany) [11].

Судороги, вызванные коразолом (ПТЗ). Тиовюрцин применяли внутрижелудочно через зонд однократно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг за 1 ч до введения коразола в дозе 140 мг/кг подкожно (п/к) в области шеи животного. Карбамазепин вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 100 мг/кг в аналогичном режиме. После введения эффективной дозы коразола (140 мг/кг п/к) у животных негативного контроля развиваются судорожные проявления в следующей последовательности (стадии): 1) одно или более миоклонических сокращений всего тела; 2) повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания; 3) генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания; 4) тоническая экстензия передних конечностей с потерей рефлекса переворачивания; 5) тоническая экстензия передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания [11]. Коразоловые судороги регистрировали через 1 ч после введения веществ, в течение 30 мин после введения коразола. У 100% контрольных животных после введения коразола регистрировали судорожные проявления, описанные в пунктах 1—3 модели. Животные, у которых не развивались судороги (после введения исследуемых веществ и затем коразола) в течение 30 мин, описанные в пункте 2, — повторяющиеся клонические судороги передних и/или задних конечностей длительностью более чем 3 с без потери рефлекса переворачивания или судороги последующих 3—5-й стадий, — рассматривались как «защищенные». Основным критерием эффективности являлось увеличение продолжительности жизни животных и количество выживших животных (%) [10].

Судороги, вызванные тиосемикарбазидом (ТСК). Тиовюрцин применяли внутрижелудочно через зонд однократно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг за 1 ч до введения тиосемикарбазида в дозе 30 мг/кг п/к в области шеи животного. Карбамазепин вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в таком же режиме. Критериями противосудорожной активности служили увеличение времени до первого судорожного приступа (латентный период), частота возникновения клонико-тонических судорог и гибель животных (%). Мышей, выживших в течение 90 мин после инъекции тиосемикарбазида, относили к категории «защищенных» [9, 10].

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica 10. Распределение полученных величин отличалось от нормального (в соответствии с критерием Шапиро—Уилка), поэтому для множественного сравнения применяли критерий Краскела—Уоллиса, для межгруппового сравнения — U-критерий Уилкоксона—Манна—Уитни, для выявления уровня значимости различий качественных показателей — критерий углового преобразования Фишера (φ). Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое значение признака (M) и стандартную ошибку среднего значения (m), которые вместе со значением n (количество животных) представлены в итоговых таблицах. Во всех случаях нулевую гипотезу отвергали при p<0,05 [11].

Как видно из табл. 1, в условиях эпилептогенеза, вызванного подкожной инъекцией ПТЗ, карбамазепин проявлял выраженную противосудорожную активность: по сравнению с контролем увеличивал латентный период для миоклонических, генерализованных клонических и тонических судорог, значительно снижал количество эпизодов тонических судорог, на фоне статистически значимого (в 1,9 раза) удлинения продолжительности жизни повышал количество выживших мышей с 8,3% в контроле до 33,3% (p<0,05).

Таблица 1. Влияние тиовюрцина при превентивном однократном внутрижелудочном введении (50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг) на развитие коразоловых (140 мг/кг п/к) судорог у аутбредных мышей-самцов стока СD1 (M±m)

Примечание. Здесь и в табл. 2: * — p≤0,05, ** — p≤0,01, перед уровнем значимости p указаны номера сравниваемых групп.

Тиовюрцин при однократном введении в дозе 50 мг/кг обладал слабой активностью (см. табл. 1). Наблюдалось удлинение латентного периода миоклонических судорог (на 29%), клонических судорог (на 71%) и тонических судорог (на 18%), а также увеличение продолжительности жизни животных (на 24%), однако эти изменения достигали лишь уровня статистической тенденции. По некоторым параметрам, например по количеству миоклонических судорог и генерализованных клонических судорог, лекарственное средство статистически значимо ухудшало показатели по сравнению со значениями негативного контроля. Выживаемость животных соответствовала уровню негативного контроля.

Тиовюрцин в дозе 100 мг/кг оказывал выраженный защитный эффект относительно негативного контроля, этот эффект заключался в удлинении латентного периода миоклонических судорог на 92% (p<0,01) и клонических судорог на 95% (p<0,05). Одним из наиболее значимых проявлений эффективности тиовюрцина в данной модели было статистически значимое увеличение продолжительности жизни мышей — на 73% по сравнению с группой негативного контроля (см. табл. 1). Этот результат был сопоставим с эффектом карбамазепина. Согласно основному критерию эффективности — доле выживших животных (%), тиовюрцин обеспечивал выживаемость 41,7% мышей, что превышает показатель в группе карбамазепина (33,3%). Защитный эффект тиовюрцина в дозе 200 мг/кг по сравнению с негативным контролем проявлялся в увеличении латентного периода миоклонических судорог на 65% (p<0,05) и снижении количества клонических судорог на 25% (p<0,05). Однако вещество в этой дозе не повысило выживаемость мышей, которая осталась на уровне негативного контроля и составила 9,1%. Выявленная противосудорожная активность тиовюрцина в дозе 200 мг/кг оказалась существенно слабее по сравнению с эффектом дозы 100 мг/кг, что может указывать на узкий терапевтический диапазон тиовюрцина.

На модели судорог, вызванных подкожным введением ТСК в дозе 30 мг/кг, эффективность карбамазепина выражалась в статистически значимом увеличении латентного периода всех типов судорог, снижении количества тонических судорог на 25% (p<0,01) и повышении продолжительности жизни животных на 48% (p<0,01) по сравнению с негативным контролем (табл. 2). Значительное увеличение выживаемости мышей, до 70% (против 10% в контроле), подтверждает валидность экспериментальной модели.

Таблица 2. Влияние тиовюрцина при превентивном однократном его введении на развитие судорог, вызванных введением тиосемикарбазида (30 мг/кг п/к), у мышей-самцов стока CD-1

Тиовюрцин в исследованных дозах (50—200 мг/кг) не проявил защитного противосудорожного действия, сопоставимого с карбамазепином (см. табл. 2). По параметру латентного времени судорог ни в одной из доз тиовюрцин не продемонстрировал стабильного и значимого увеличения времени до наступления всех типов судорог. Показатели в группах исследуемого вещества были либо сравнимы с контролем, либо статистически значимо меньше, чем в группе карбамазепина. Однако введение тиовюрцина в дозе 100 мг/кг приводило к снижению количества наиболее тяжелых тонических судорог на 31% (p<0,05) и увеличению латентного периода их возникновения на 23% (p>0,05) по сравнению с показателями группы негативного контроля. При этом уровень выживаемости животных в этой группе составил 20%, что статистически не отличалось от контроля (10%) и было значимо ниже, чем в группе карбамазепина. Вещество не оказывало влияния на общую продолжительность жизни мышей: во всех опытных группах, получавших тиовюрцин, этот показатель был сопоставим с группой негативного контроля и статистически значимо меньше, чем в группе карбамазепина. Применение тиовюрцина в дозах 50 и 200 мг/кг не повышало выживаемость, которая составила 0%, что также не отличалось от показателя негативного контроля (10%).

Общность патофизиологических механизмов хронических болевых синдромов и эпилепсии, включающая феномены центральной сенситизации и дисфункцию ионных каналов, обусловливает терапевтическую эффективность антиконвульсантов при нейропатической боли [4, 6]. Выявленная в данном исследовании противосудорожная активность тиовюрцина подтверждает перспективность его использования при коморбидных состояниях, когда эпилепсия и болевые расстройства имеют единый нейрональный субстрат [6].

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) — главный тормозной нейромедиатор центральной нервной системы (ЦНС). Ее основная функция заключается в снижении возбудимости нейронов и подавлении избыточной активности. Дисфункция ГАМК-системы представляет собой общий патологический механизм, лежащий в основе развития судорожного синдрома и хронической боли. В связи с этим коррекция этой дисфункции служит ключевым механизмом действия многих высокоэффективных анальгетиков и противоэпилептических препаратов [6, 8, 9].

Ключ к интерпретации результатов противосудорожного действия тиовюрцина в тестах с ПТЗ и ТСК (стандартными химическими проконвульсантами) лежит в понимании механизма действия провоцирующего агента и его антагонизма исследуемым веществом. Пентилентетразол является классическим неконкурентным антагонистом ГАМК-рецепторов, а его проконвульсивное действие обусловлено блокадой хлорных ионных каналов, ассоциированных с этими рецепторами, что не исключает его неспецифического проконвульсивного мембранотропного действия. Применение ПТЗ приводит к снижению тормозного ГАМКергического тонуса в ЦНС, смещению баланса в сторону возбуждения и синхронизации разрядов нейронов, что клинически проявляется в характерной последовательности: миоклонические → клонические → тонические судороги. В связи с вышесказанным тест коразоловых судорог позволяет идентифицировать соединения, которые усиливают ГАМКергическую нейротрансмиссию, вызывают модуляцию ионных каналов, стабилизацию мембран. Учитывая ранее установленную способность тиовюрцина модулировать активность TRPA1- и TRPV1-рецепторов, а также кальциевых каналов [3], его защитный эффект в этом тесте может быть обусловлен стабилизацией мембран нейронов. Модуляция вольтаж-зависимых кальциевых каналов является признанной стратегией снижения избыточной возбудимости ЦНС, характерной как для эпилептогенеза, так и для формирования болевой гиперчувствительности [5]. Наблюдаемый выраженный защитный эффект тиовюрцина в дозе 100 мг/кг, сопоставимый по продолжительности жизни и даже превосходящий эффект карбамазепина по ключевому параметру — выживаемости (41,7%), позволяет выдвинуть гипотезу о принципиально ином, возможно, прямом или непрямом воздействии на ГАМКергическую передачу. Удлинение латентного периода для всех типов судорог и значительное увеличение продолжительности жизни указывают на то, что тиовюрцин эффективно противодействует начальному триггерному действию коразола. Наиболее вероятным механизмом является потенцирование тормозного действия ГАМК, что могло бы компенсировать блокаду рецепторов коразолом. Вероятно, это могло бы происходить через аллостерическую модуляцию ГАМК-рецептора (по типу бензодиазепинов или барбитуратов); ингибирование обратного захвата ГАМК или подавление ее метаболизма (по типу вальпроатов), непрямое усиление ГАМКергического тонуса через другие системы (по типу прегабалина и габапентина). Слабая и противоречивая активность в дозе 50 мг/кг может свидетельствовать о недостаточной концентрации вещества для эффективной компенсации блокады ПТЗ, а ухудшение некоторых показателей (количество судорог) может указывать на сложную, нелинейную модуляцию нейрональных сетей субтерапевтической дозой. Резкое снижение эффективности и отсутствие улучшения выживаемости в дозе 200 мг/кг, несмотря на сохранения эффекта по повышению латентного периода тонических судорог и снижению количества клонических судорог, является наиболее показательным. Такой куполообразный дозозависимый эффект (с максимумом активности при 100 мг/кг) часто характерен для веществ, действующих на нейромедиаторные рецепторы. В целом настоящее исследование позволяет заключить, что тиовюрцин в оптимальной дозе проявляет высокую активность в модели, патогенез которой связан с угнетением ГАМКергической системы, а его первичный механизм действия может быть обусловлен усилением ГАМК-опосредованного торможения. Вместе с тем узкий терапевтический диапазон и потеря эффективности при высокой дозе требуют определенной осторожности в определении терапевтического окна.

Тиосемикарбазид, являясь ингибитором глутаматдекарбоксилазы, вызывает судороги не напрямую, а опосредованно, через подавление синтеза тормозного нейромедиатора ГАМК в головном мозге, тем самым нарушая баланс между возбуждающими (глутамат) и тормозными (ГАМК) сигналами. Отсутствие значимого антиконвульсивного эффекта тиовюрцина на модели судорог, индуцированных тиосемикарбазидом (ТСК), указывает на то, что соединение не способно компенсировать глубокий дефицит эндогенной ГАМК, возникающий при ингибировании глутаматдекарбоксилазы. В отличие от ПТЗ-модели, где возможны аллостерическая модуляция рецепторов или влияние на ионные токи [10], ГАМК-дефицитные модели более резистентны к препаратам с непрямым механизмом действия, что позволяет точнее ограничить спектр нейротропной активности тиовюрцина [10]. Таким образом, механизм действия тиовюрцина неэффективен в ГАМК-дефицитной модели судорог, а его действие направлено «в обход» основной причины судорог в этом тесте. Единственный позитивный эффект (снижение тяжелых тонических судорог на 31% при 100 мг/кг) может указывать на то, что механизм действия тиовюрцина имеет очень узкое терапевтическое окно или проявляется лишь в определенных субпопуляциях нейронов. Отсутствие изменения ключевого показателя (выживаемость 20% против 10% в контроле, p>0,05) означает, что даже частичное снижение тяжести судорог не предотвратило летальный исход, связанный с неконтролируемой электрической активностью мозга и/или системными нарушениями. Отсутствие противосудорожного действия тиовюрцина в данной модели является не столько показателем его полной неэффективности, сколько важным фармакологическим маркером, уточняющим и ограничивающим его механизм действия в сравнении с классическим антиконвульсантом. В подтверждение вышесказанного свидетельствуют результаты выраженного противосудорожного действия тиовюрцина на модели коразоловых судорог, более релевантной для его предполагаемого механизма действия. Вместе с тем вероятно, что применяемые вот уже шесть десятилетий стандартные скрининговые модели (ПТЗ, ТСК и др.) выявляют только вещества, аналогичные существующим, и не позволяют обнаружить более эффективные препараты с новыми механизмами действия [8, 10].

Проведенное исследование противосудорожного действия разработанного прототипа анальгетика не только представляет академический интерес, но и позволяет прогнозировать с определенной долей вероятности эффективность исследуемого вещества при хронических, особенно нейропатических, болевых синдромах, а также указывает на возможные нейрональные механизмы его действия. Полученные данные дополняют результаты доклинического исследования эффективности и безопасности нового анальгетика, что позволяет улучшить его профиль безопасности, прогнозировать расширение его терапевтических возможностей и потенциал для лечения коморбидных состояний.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (проект 122020200058-6: «Поиск, разработка и изучение механизмов действия синтетических и природных биологически активных субстанций, полученных, в том числе, на основе биотехнологий, для фармакологической коррекции различных патологических процессов»).

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания ИПХЭТ СО РАН (проект №124021200030-7: «Разработка методов и технологий синтеза биологически активных веществ на основе азотсодержащих полициклических соединений»).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.