Клинико-генетическое описание нейронального цероидного липофусциноза 6 типа в якутской семье

Нейрональный цероидный липофусциноз (НЦЛ) представляет собой наиболее распространенную группу нейродегенеративных заболеваний детского возраста, характеризующихся накоплением аутофлуоресцентных липопигментов в различных тканях [1]. Частота встречаемости НЦЛ в мире составляет от 1 до 8 на 100 000 новорожденных [2]. В настоящее время идентифицировано 14 типов НЦЛ (НЦЛ1-НЦЛ14), среди них в мире наиболее часто встречаются типы НЦЛ 1 типа, НЦЛ 2 типа и НЦЛ 3 типа [3]. В России наиболее распространенными являются НЦЛ 2 типа и НЦЛ 7 типа [4]. Всего описано 13 генов, которые вызывают НЦЛ (CLN1/PPT1, CLN2/TPP1, CLN3, CLN4/DNAJC5, CLN5, CLN6, CLN7/MFSD8, CLN8, CLN10/CTSD, CLN11/GRN, CLN12/ATP13A2, CLN13/CTSF и CLN14/KCTD7) [5,6]. Большинство типов НЦЛ — это аутосомно-рецессивные заболевания, за исключением типа, вызванного мутацией в гене CLN4/DNAJC5, при котором заболевание имеет аутосомно-доминантный характер наследования [7]. В этих идентифицированных генах выявлены более 500 патогенных вариантов, которые являются причиной заболевания [2, 3].

НЦЛ 6 типа (OMIM 601780) относится к поздним инфантильным формам НЦЛ, вызван мутациями в гене CLN6. Ген CLN6 расположен на хромосоме 15q22-23 и кодирует белок, состоящий из 311 аминокислотных белков с 7 трансмембранными доменами [8]. В гене CLN6 согласно базе данных «NCL Mutation and Patient Database» (https://www.ucl.ac.uk/ncl-disease/mutation-and-patient-database) было установлено более 130 патогенных мутаций в разных популяциях, ответственных за причину широкой генетической гетерогенности заболевания. Белок CLN6 участвует в эндоцитозе лизосомальных белков, селективном транспорте липидов и белков, связанных с функцией и подкислением лизосом, и аутофагии [5, 9]. Возраст начала заболевания при НЦЛ 6 типа варьирует от 18 мес до 8 лет. Тип наследования заболевания аутосомно-рецессивный. Клинически дебютирует в виде прогрессирующей неврологической симптоматики — атаксии, эпилептических приступов, задержки психомоторного развития, нарушения зрения [10]. Пациенты с НЦЛ 6 типа были зарегистрированы в нескольких странах, в таких как Чешская Республика, Хорватия, Португалия, Америка, Европа, Индия, Пакистан, Турция, Китай и Япония [11—15]. В отечественной литературе исследований, посвященных НЦЛ, немного [4, 16]. В Якутии до настоящего времени данное заболевание не изучалось.

В статье представлены клинические, молекулярно-генетические характеристики больных — членов одной якутской семьи с НЦЛ 6 типа, причиной которого является мутация в гене CLN6.

Обследование семьи начиналось с осмотра врачом-генетиком и заполнения специально составленного протокола, включающего сроки проявления признаков заболевания, данные неврологического осмотра, функциональных и инструментальных методов исследования, генеалогическую карту.

Для молекулярно-генетического исследования использована ДНК пробанда и членов семьи, выделенная из образцов цельной крови. Кровь была взята с письменного согласия у родителей пациентов и членов семьи с заполнением информированного согласия. ДНК выделяли из 9 мл периферической крови стандартным методом с использованием протеиназы K и последующей фенольно-хлороформной экстракцией. В качестве консерванта использовали 0,5М ЭДТА. Все этапы пробоподготовки для парно-концевых ДНК библиотек и непосредственного секвенирования проведены согласно инструкции производителя Illumina (Illumina Inc., США). Молекулярно-генетический анализ был проведен у пробанда III-4 и ее родителей II-2, II-3 на секвенаторе MiSeq (Illumina Inc., США) с использованием панели Trusight Inherited Diseases Sequencing Panel (Illumina Inc., США), которая включает 552 целевых гена, ответственных за развитие тяжелых наследственных заболеваний детского возраста с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Исследование проведено на базе научно-исследовательской лаборатории «Молекулярная медицина и генетика человека» Медицинского института ФГАОУ ВО «Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова» и Медико-генетического центра ГАУ РС(Я) Республиканской больницы №1 — Национального центра медицины. Настоящее исследование было одобрено локальным этическим комитетом Медицинского института ФГАОУ ВО «Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова» (Протокол №22 от 26.02.20).

Пробанд (III-4): 8-летняя девочка, рожденная от неродственного брака. Родители пробанда якутской этнической группы, здоровые. Родословная представлена на рис. 1. Пробанд родилась от четвертой беременности, от вторых естественных родов, с весом при рождении 4120 г, ростом 56 см. Оценка по шкале Апгар — 8/9 баллов. До 3 лет ребенок развивался без особых отклонений, но отмечалась некоторая задержка речевого развития. В возрасте 3 года 9 месяцев ребенок стал часто падать, особенно на ягодичную область, появилась слабость в ногах. В 4 года больная не могла приседать из-за слабости в ногах, перестала ходить, начала передвигаться на четвереньках, возникли нарушения мелкой моторики, трудности с засыпанием, появились частые миоклонические приступы. МРТ головного мозга выявила атрофию полушарий и червя мозжечка. Видео-ЭЭГ-мониторинг регистрировал эпилептическую активность в виде комплексов пик-волна по морфологии доброкачественные эпилептиформные паттерны детства в правой центрально-височной области. Была назначена вальпроевая кислота. Молекулярно-генетические исследования на частые атаксии не выявили патологии. На основании неврологических симптомов и данных исследований головного мозга был установлен клинический диагноз лейкодистрофия. В возрасте 6 лет пациентка госпитализирована в отделение психоневрологии с жалобами на нарушение походки, частые падения, задержку психоречевого развития. МРТ головного мозга выявила атрофию коры, двустороннюю перивентрикулярную лейкоэнцефалопатию и атрофию мозжечка (рис. 2). По электроэнцефалограмме на фоне замедленной корковой активности с частотой 6 Гц регистрировалась пароксизмальная медленноволновая активность с включением множественных нечетких эпилептиформных комплексов по типу острая-медленная волна и двухфазных острых волн без четкой локализации. Исследование с помощью тандемной масс-спектрометрии не выявило данных за наследственные аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального бета-окисления. Больная была выписана с диагнозом «нейродегенеративное заболевание неясного генеза». В возрасте 8 лет окулистом была выявлена субатрофия зрительного нерва обоих глаз, в неврологическом статусе при осмотре продуктивному контакту была недоступна из-за выраженных когнитивных нарушений, больная самостоятельно не могла сидеть и ходить, наблюдались миоклонические приступы.

Рис. 1. Родословная пациента с НЦЛ 6 типа (НЦЛ 6 типа).

Стрелка указывает на пробанда (III-4); родители здоровые, являются гетерозиготными носителями мутации (II-2, II-3); сибс (III-5) тоже больна НЦЛ 6 типа.

Рис. 2. МРТ головного мозга пробанда в возрасте 6 лет.

а — сагиттальное T1-взвешенное изображение: видны атрофия мозжечка, атрофия коры головного мозга; б — коронарное T2-взвешенное изображение: наблюдается гиперинтенсивность перивентрикулярного белого вещества, атрофия мозжечка; в — аксиальное T2-взвешенное изображение FLAIR: корковая атрофия, наблюдается повышенная интенсивность МР-сигнала в перивентрикулярном белом веществе.

У младшей сестры пробанда (III-5), девочки 5 лет, наблюдались сходные симптомы и прогрессирующее течение, которые дебютировали в возрасте 4 лет. МРТ головного мозга выявила изменение интенсивности МР-сигнала в перивентрикулярной области белого вещества головного мозга с обеих сторон. Кроме того, у пациентки на первом году жизни была диагностирована гепатобластома в правой доле печени с метастазами в легкие, по поводу которой она получала комплексное лечение в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина (Москва). На момент данного исследования у нее наблюдается ремиссия рака печени; однако неврологические симптомы продолжают прогрессировать, больная не может самостоятельно сидеть и ходить. Офтальмоскопия выявила признаки ангиопатии сетчатки.

В результате молекулярно-генетического анализа у пробанда была обнаружена мутация c.396dupT (p.Val133CysfsTer18) в 4 экзоне гена CLN6, приводящая к сдвигу рамки считывания (референсный транскрипт: NM_017882.2) в гомозиготном состоянии, а также у ее родителей в гетерозиготном состоянии. Данный вариант ранее не был описан в ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) и отсутствовал в базах данных вариантов dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), HGMD (http: //www.hgmd. cf.ac.uk/), LOVD (https://www.lovd.nl/). Вариант c.396dupT был предсказан как патогенный на основе анализа биоинформатических программ SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg/; оценка 0,000), PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/; Оценка HumDiv 1.000, оценка HumVar 0.998) и MutationTaster (https://www.mutationtaster.org/; оценка 1.000). Биоинформатический анализ и интерпретация найденных вариантов проведены согласно «Руководству по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученными методами массового параллельного секвенирования» [17].

Для подтверждения результатов полноэкзомного секвенирования проведено прямое секвенирование по Сэнгеру на генетическом анализаторе ABI 3500 (Life Technologies, USA), с использованием олигонуклеотидных праймеров (см. таблицу).

Праймеры и условия проведения ПЦР участков гена CLN6

Результаты были аннотированы с использованием программного пакета SeqScape 3.0 Software (Applied Biosystems, USA), где подтвердилось наличие мутации c.396dupT в гене CLN6 у пробанда в гомозиготном состоянии (рис. 3, а). У сибса (III-5) также был обнаружен гомозиготный вариант выявленной мутации путем прямого секвенирования.

Множественное выравнивание последовательностей с помощью программы MUSCLE Sequence Alignment Tool (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) показало, что аминокислота валин в позиции 133 (Val133) высоко консервативна в процессе эволюции у семи позвоночных видов: Homo sapiens, Canis lupus, Bos Taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Gallus и Xenopus tropicals (рис. 3, б).

Рис. 3. Результаты молекулярно-генетического исследования.

а — результаты секвенирования по Сэнгеру якутской семьи, показывающие гомозиготный вариант c.396dupT в 4 экзоне гена CLN6 у больных сибсов и их родителей; б — анализ аминокислотной последовательности гена CLN6 с использованием инструмента MUSCLE Sequence Alignment Tool показывает, что Val133 высоко консервативен среди позвоночных. Выровненные гомологичные последовательности были получены от HomoloGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/).

НЦЛ 6 типа — рецессивно наследуемое нейродегенеративное заболевание, вызывающее эпилепсию, нарушение когнитивных функций, потерю зрения, регресс психомоторного развития [18]. Мутации в гене CLN6 были первоначально идентифицированы и картированы на хромосоме 15q21-23 у пациентов из Коста-Рики и Венесуэлы [19]. На сегодняшний день зарегистрировано более 130 патогенных вариантов CLN6, и о большинстве из них сообщается в базе данных «NCL Mutation and Patient Database» (https://www.ucl.ac.uk/ncl-disease/mutation-and-patient). С помощью массового параллельного секвенирования нами выявлена гомозиготная мутация c.396dupT (p.Val133CysfsTer18) в гене CLN6, приводящая к сдвигу рамки считывания и явившаяся причиной НЦЛ 6 типа в якутской семье. Данная мутация также была обнаружена в другой семье [4], вероятно, якутской национальности.

Якуты — это восточноазиатский народ, проживающий в северо-восточной части Сибири в Российской Федерации. В якутском населении часто встречаются некоторые редкие моногенные наследственные заболевания. Было доказано воздействие эффекта основателя, хорошо описанного в некоторых популяциях, который также был подтвержден в якутской популяции N. Maksimova и соавт. [20]. Таким образом, весьма вероятно, что данная мутация встречается с высокой частотой среди якутских больных, что требует дальнейшего изучения.

НЦЛ 6 типа характеризуется быстро прогрессирующим течением, приводящим к тяжелой инвалидизации пациентов. В приведенном случае у пробанда было поражение зрения, типичное для НЦЛ 6 типа, однако в недавних публикациях сообщается, что нарушение зрения не всегда возникает при этом заболевании [20]. В настоящее время проводятся клинические исследования генной терапии детей с НЦЛ 6 типа с использованием серотипа аденоассоциированного вируса 9 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02725580) [21]. Поэтому ранняя диагностика этого заболевания может быть целесообразной для подобной терапии в будущем.

В заключение следует отметить, что диагностика НЦЛ вызывает трудности ввиду выраженной генетической гетерогенности заболевания, а также из-за сходства по клиническим проявлениям с другими наследственными метаболическими заболеваниями. Введение в клиническую практику новых технологий ДНК-диагностики, таких как метод массового параллельного секвенирования (МПС, NGS) с использованием таргетных панелей, позволило сократить время исследования и, главным образом, выявить молекулярно-генетическую причину заболевания.

Работа поддержана Государственным заданием Министерства науки и высшего образования РФ (проект №FSRG-2020-0014 «Геномика Арктики: эпидемиология, наследственность и патология»).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.