Применение плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, при экспериментальной перфорации барабанной перепонки

Вопросы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения перфораций барабанной перепонки (ПБП) сохраняют свою актуальность [1—4]. В настоящее время хорошо изучены и определены этапы и характер изменений в тканях барабанной перепонки, среднего уха, слуховой трубы при воспалительных процессах. Разработано также большое количество способов консервативного и хирургического закрытия ПБП [5—8]. Однако, несмотря на это, процессы дифференцировки клеточных структур, пролиферации тканей барабанной перепонки в ходе воспалительных процессов остаются недостаточно изученными, что связано с нарушениями микроциркуляции и реологии крови в ишемизированных тканях, гипоксическим повреждением клеток и индивидуальными особенностями реакции организма на повреждение. Известно, что существующие различные методики закрытия ПБП не всегда эффективны, что в дальнейшем может способствовать росту случаев развития хронического среднего отита, развитию тугоухости [9—11], именно поэтому необходимо детальное изучение процессов апоптоза, регенерации и цитоархитектоники барабанной перепонки при ее повреждении. Экспериментальное изучение репарации ПБП преследует своей целью выявление новых аспектов физиологических и патогенетических этапов развития регенерационных процессов в барабанной перепонке, а также дает возможность оценивать эффективность терапевтических воздействий, применяемых на определенном этапе развития патологического процесса.

На сегодняшний день опубликовано много работ, подтверждающих эффективность использования плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, в пластической хирургии, косметологии, травматологии, стоматологии. В доступной нам литературе имеется небольшое количество данных об использовании плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, в оториноларингологии: в качестве опоры для неотимпанальной мембраны при мирингопластике [12] и профилактики осложнений после септопластики и для хирургического лечения перфорации перегородки носа [13].

Вместе с тем экспериментальные данные об использовании плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, для закрытия травматической ПБП во время оперативного вмешательства в настоящее время отсутствуют [12, 14].

Цель исследования — изучить в эксперименте влияние плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, на регенераторные процессы в тканях перфорированной барабанной перепонки.

Эксперименты выполнили на 36 крысах-самцах, линии Wistar, возраст 3 мес, масса тела 230—250 г (оценивали 72 барабанные перепонки). Все работы с животными провели в соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.10 по охране животных, используемых в научных целях (статья 27), а также требованиями и рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» («Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» National Academy Press, USA, 2011). Выбор в качестве экспериментальной модели крысы был не случаен, поскольку данное лабораторное животное имеет сходное строение барабанной перепонки с человеком. Животное является экономически «выгодной» моделью для исследования, неприхотливо в уходе, имеет широкий наружный слуховой проход (тем самым доступна визуализации барабанная перепонка при отоскопии). Барабанная перепонка крысы, так же как у человека, состоит из двух частей: натянутой и ненатянутой, и имеет трехслойное строение. Первый, эпидермальный, слой представлен ороговевающим плоским эпителием. Второй слой состоит из фиброзных волокон соединительной ткани. Наконец, третий слой представляет собой эпителиальные клетки слизистой оболочки. Между этими слоями находятся тонкие косые волокна. Эпидермальный слой содержит в своем составе 3—5 клеточных слоев. Слой соединительной ткани в свою очередь содержит радиальные волокна, расположенные ближе к эпидермальному слою барабанной перепонки, и циркулярные волокна, расположенные ближе к слизистому слою барабанной перепонки. Волокна соединительной ткани имеют сходство с коллагеновыми и эластиновыми волокнами. В ненатянутой части барабанной перепонки эластиновые волокна преобладают над коллагеновыми. Помимо этого, в соединительной ткани барабанной перепонки располагается сеть сосудов микроциркуляторного русла. Внутренний слизистый слой барабанной перепонки непрерывно переходит в слизистую оболочку среднего уха, он состоит из реснитчатых столбчатых эпителиальных клеток. Ближе к периферии слизистый слой барабанной перепонки представлен многорядным мерцательным эпителием, а в центре барабанной перепонки — однослойным плоским или кубическим эпителием.

В ходе исследования выделили две группы лабораторных животных: 1-ю (экспериментальную, 18 голов) и 2-ю (контрольную, 18 голов). Рандомизацию животных проводили методом «конвертов». Животные сравниваемых групп не различались по массе тела: 239±6 и 242±5 г в 1-й и 2-й группах соответственно. Перед началом эксперимента провели отоскопию на предмет наличия признаков воспаления, ПБП, инородных тел в наружном слуховом проходе. В ходе эксперимента травматическую ПБП выполняли в условиях общей анестезии стерильной иглой размером (0,6×30 мм) 23 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия) в задненижнем квадранте барабанной перепонки. Общую анестезию осуществляли препаратами Золазепам и Ксилазин из расчета 5 мг препарата/1 кг массы тела животного внутримышечно стерильной иглой размером 25 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). В экспериментальной группе животных (1-я группа) произвели забор 1 мл крови из хвостовой вены каждой мыши с помощью стерильной иглы 30 G U-40 Insulin 0,30×8 мм (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). Затем кровь помещали в стерильную вакуумную пробирку объемом 1,8 мл с цитратом натрия 3,8% (PUTH OOO «Вита Хели», Ижевск). Этап центрифугирования крови с 3,8% цитратом натрия проводили в режиме 230 rpm 8 мин (центрифуга СМ-12−0-6, фабрика «НК Групп», Россия). После центрифугирования осуществляли разделение крови на 3 части: плазма крови с тромбоцитами, лейкоцитами и эритроцитами. Часть плазмы крови, содержащую тромбоциты, отбирали с помощью стерильной пипетки Пастера, добавляли катализатор (1 капля 10% раствора CaCl). Через 15 мин происходило образование сгустка, обогащенного тромбоцитарными факторами роста. Полученный тромбоцитарный сгусток вводили в наружный слуховой проход животных экспериментальной группы однократно аппликационно. Визуальную оценку регенерации барабанной перепонки производили при помощи отоскопа Welch Allyn Surgitek (США) ежедневно.

Для гистологического сравнения барабанной перепонки животных 1-й и 2-й групп их последовательно партиями выводили из эксперимента через 5, 10 и 15 дней после операции. После выведения из эксперимента вскрывали буллы височных костей и помещали их в 10% забуференный раствор формальдегида («Merkc», США). Барабанные перепонки выделяли из височных костей тупым путем, образцы промывали в 1% фосфатно-солевом буфере (pH 7.4) (Invitrogen, Mulgrave, Australia), обезвоживали в 70% этаноле в течение 2 мин. Затем ткани обрабатывали с использованием тканевого прессора Leica (модель TP 1020) и заливали в парафин. На ротационном микротоме готовили парафиновые срезы толщиной 5—6 микрометров и фиксировали на адгезивных стеклах HistoBond («Marien-feld», Германия). Гистологические срезы окрашивали обзорными гистологическими методиками (с использованием гематоксилина Майера и эозина, а также по методу Ван-Гизона). Срезы депарафинировали и после гидратирования при помощи ксилола размещали на покровных стеклах и оставляли для сушки на 24 ч, затем производили микроскопическую оценку исследуемых тканей.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7.0 методом ANOVA и критерия U Вилкоксона—Манна—Уитни. Различия между группами на этапах эксперимента считали достоверными при р≤0,05.

По результатам проведенного исследования, было установлено, что в экспериментальной группе животных (1-я группа) на 5-е сутки после операции признаков воспалительных изменений не было, закрытие ПБП выявили в 4 случаях (рис. 1),

На 10-е сутки после операции в 1-й группе развитие явлений воспаления выявили в 1 случае, «сухая» ПБП сохранилась в 1 случае, закрытие ПБП выявили в 10 случаях. В те же сроки после операции во 2-й группе признаки воспалительных изменений выявили в 6 случаях, «сухая» ПБП сохранилась в 6 случаях, случаев закрытия ПБП не было. Частота закрытия ПБП в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (p<0,01).

На 15-е сутки после операции в 1-й группе не было отмечено признаков воспалительного процесса, «сухая» ПБП сохранилась в 1 случае, закрытие ПБП выявили в 11 случаях. На 15-е сутки после операции во 2-й группе наличие признаков воспаления выявили в 1 случае, «сухая» ПБП сохранилась в 10 случаях, закрытие ПБП отметили в 1 случае. Частота закрытия ПБП на этом этапе в 1-й группе была достоверно больше, чем во 2-й, и составила 69,4 и 2,78% соответственно (p<0,05). Частота сохранения ПБП без признаков воспаления («сухая» перфорация) в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й, — 52,8 и 27,8% соответственно (p<0,05).

Плазма крови, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, благоприятно влияет на регенерацию барабанной перепонки в условиях ее травматической перфорации в эксперименте на крысах, что проявляется в уменьшении частоты развития воспалительных изменений на 5-й день после перфорации и увеличении частоты закрытия ПБП как на 10-й, так и на 15-й день.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Крюков А.И. — e-mail: kryukovai1@zdrav.mos.ru; https://orcid.org/0000-0002-0149-0676

Гуров А.В. — e-mail: alex9999@inbox.ru; https://orcid.org/0000-0001-9811-8397

Ельчанинов А.В. — e-mail: elchandrey@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-2392-4439

Мурзаханова З.В. — e-mail: z-u-l-4-i-k@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7412-6448

Муратов Д.Л. — e-mail: lorrsmu@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Гуров А.В. — e-mail: alex9999@inbox.ru

Крюков А.И., Гуров А.В., Ельчанинов А.В., Мурзаханова З.В., Муратов Д.Л. Применение плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, при экспериментальной перфорации барабанной перепонки. Вестник оториноларингологии. 2019;84(6):17-21. https://doi.org/10.17116/otorino20198406117