Молекулярный анализ генов иммуноглобулина в опухолевых B-клетках при лимфоме селезенки из клеток маргинальной зоны

АИГА — аутоиммунная гемолитическая анемия

ВБП — выживаемость без прогрессирования

КМ — костный мозг

ЛДГ — лактатдегидрогеназа

ЛСКМЗ — лимфома селезенки из клеток маргинальной зоны

ОВ — общая выживаемость

СЭ — спленэктомия

B-ХЛЛ — В-клеточный хронический лимфолейкоз

SE — стандартная ошибка

В-клеточная лимфома селезенки из клеток маргинальной зоны (ЛСКМЗ) — В-клеточная опухоль, представленная морфологически зрелыми лимфоидными клетками, по своим иммунологическим характеристикам соответствующим лимфоцитам маргинальной зоны вторичного фолликула. Клинически характеризуется спленомегалией, умеренным лимфатическим лимфоцитозом, обычно очаговым поражением костного мозга (КМ), иногда умеренной секрецией моноклонального иммуноглобулина в сыворотке (обычно IgM или IgG) и/или моче и относительно доброкачественным течением [1—4].

Сопоставления данных иммунофенотипического исследования и мутационного статуса генов IgVH показали, что в маргинальных зонах содержится по меньшей мере 4 субпопуляции В-лимфоцитов с различным мутационным статусом [5—7]. Согласно результатам анализа вариабельного региона тяжелой цепи генов иммуноглобулинов (VH) из небольшого числа случаев ЛСКМЗ большинство из них подвергались соматической гипермутации, что имеет большое значение для представления о происхождении этой лимфомы [8—14].

Приводим собственные результаты, полученные в ходе проведенного исследования, цель которого состояла в определении классов генов IgVH, их соматической мутации и сопоставление этих данных с клинико-лабораторными параметрами пациентов и исходами заболевания.

Пациенты. Анализ генов VH проведен у 24 пациентов с ЛСКМЗ. Клинический диагноз установлен на основании стандартных критериев [2, 15]: результатов гистологического и иммуногистохимического исследований КМ, а также иммунофенотипирования лимфоидных клеток периферической крови и/или КМ.

Обследуемая популяция включала 15 женщин и 9 мужчин, медиана возраста при установлении диагноза составила 60 лет (диапазон от 32 до 71 лет). Их основные клинические характеристики отражены в табл. 1.

Анализ генов IgVH. Для определения клональной перестройки IgVH ДНК пациентов амплифицировали в 6 отдельных реакциях с использованием праймеров, специфичных к семействам VH, и консенсусного праймера JH [16, 17]. Клональный продукт очищали в 2% агарозном геле и элюировали с помощью набора Diatom DNA Elution («Биоком», Россия). Продукт полимеразной цепной реакции секвенировали с праймера, специфичного семейству перестроенного гена VH, с использованием набора флуоресцентно-меченных красителей Big Dye Terminator v1.1. («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США). Полученные последовательности сравнивали с имеющимися в базе данных IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast). Пороговым значением сходства с герминальными генами считали 98%.

Статистический анализ. В качестве критериев («конечных точек») исходов лечения ЛСКМЗ использованы общая выживаемость (ОВ) и выживаемость без прогрессирования (ВБП). Для О.В. время отсчитывали от даты установления диагноза до летального исхода (от любой причины) или последней информации о пациенте, при ВБП — от даты спленэктомии (СЭ), рассматриваемой как начало лечения, до первой прогрессии или летального исхода (от любой причины). Согласно В. Cheson и соавт. [18] и S. Mulligan и соавт. [19], прогрессия при ЛСКМЗ заключается в появлении новых симптомов и локализаций болезни (в частности, экстранодальных очагов поражения), увеличении на 50% и более количества лимфоцитов в периферической крови или инфильтрате КМ, увеличении на 25% и более размеров исходной органомегалии, а также гистологические признаки крупноклеточной трансформации. ОВ и ВБП рассчитаны методом Каплана—Мейера, указана стандартная ошибка (SE). При однофакторном регрессионном анализе для выживаемости использована модель пропорциональных рисков Кокса. Выполнен частотный анализ для мутационного статуса генов IgVH и следующих (бинарно представленных) демографических и клинико-лабораторных характеристик: пол, возраст, В-симптомы, уровень ЛДГ, анемия, АИГА, тромбоцитопения, секреция парапротеина, гипоальбуминемия, гистологическая и крупноклеточная трансформации. Для расчетов использован статистический пакет SAS 9.1.

Клиническая картина. Основные клинические характеристики показаны в табл. 1. У всех больных выполнена С.Э. Лимфаденопатия в виде увеличения лимфатических узлов ворот печени и/или селезенки имелась у 9 пациентов. Поражение К.М. выявлено у 100% больных, B-симптомы — у 20 (83,3%). Анемия, АИГА, тромбоцитопения (тромбоциты менее 100·10⁹/л) зафиксированы у 18, 3 и 12 пациентов соответственно. Парапротеинемия обнаружена у 12 пациентов, в большинстве случаев с изотипом IgM. Активность ЛДГ в сыворотке крови была повышена у 23 больных. Ни в одном случае серологических маркеров вирусных гепатитов В и С не обнаружено.

Гистологические и иммунофенотипические данные. Гистологическая картина трепанобиоптата КМ отражала разной степени выраженности поражение К.М. Морфологическая картина биоптата селезенки после СЭ соответствовала диагностическим критериям ЛСКМЗ [2, 15]. Иммунофенотипический анализ лимфоидных клеток периферической крови и/или пунктата КМ выявил характерную экспрессию пан-В-клеточных маркеров (CD20 и/или СD19 и/или CD79a) в отсутствие экспрессии дифференциально-диагностических антигенов, таких как CD10, CD5, CD23, CD103, CyclinD1. Отмечалась выраженная экспрессия легких цепей иммуноглобулинов: κ — в 19 и λ — в 5 случаях (см. табл. 1).

Лечение и наблюдение. Всем 24 пациентам выполнена СЭ в качестве терапии первого ряда, из них у 20 (83,3%) отмечено стабильное клинико-гематологическое улучшение. У 4 больных после СЭ развилась прогрессия заболевания, что обусловило необходимость проведение иммунохимиотерапии. Средний период наблюдения за больными составил 36,9 мес. От прогрессии заболевания, гистологически доказанной крупноклеточной трансформации умерли 2 больных на сроках наблюдения 68 и 70 мес соответственно.

Мутационный статус генов IgVH. Нуклеотидные последовательности генов IgVH определены у всех пациентов исследуемой группы. Если последовательность клонального гена VH совпадала с последовательностью одного из герминальных генов VH на 98% и более, данный ген VH считали немутированным. При условии сходства последовательности клонального гена VH с герминальным менее 98%, считали, что клетка — предшественница клона В-клеточного хронического лимфолейкоза (B-ХЛЛ) у данного больного подвергалась соматической гипермутации. Согласно этому критерию выявлены 9 (37,5%) пациентов с немутированными генами VH и 15 (62,5%) с мутированными. В исследуемой группе гены VH у 14 (58,4%) пациентов принадлежали к семейству VH1, у 12 (50% от общего числа) из них определен ген VH1—2, у 7 (29,1%) — гены семейства VH3 (из них у 3 ген VH3—7), в 2 (8,4%) случаях — гены семейства VH4 и в 1 (4,1%) — VH6 (табл. 2).

ОВ за 7 лет (см. рисунок а) для всей группы больных ЛСКМЗ составила 60% (медиана общей продолжительности жизни 80 мес), 7-летняя ВБП (см. рисунок б) — 67% (медиана продолжительности жизни без прогрессирования 60 мес). Выявлена тенденция к более частому прогрессированию заболевания у пациентов с немутированными генами IgVH (n=9) по сравнению с таковой у пациентов с мутированными генами (n=15): ВБП 53 и 67% соответственно (см. рисунок в). Наличие немутированных генов IgVH ассоциировано с увеличением вероятности прогрессии заболевания примерно в 2 раза (отношение рисков 2,0 при 95% доверительном интервале от 1,1 до 3,5). В группе пациентов с мутированными генами IgVH медиана ВБП не достигнута.

ЛСКМЗ, как правило, имеет неуклонно прогрессирующее клиническое течение, однако у отдельных больных имеет более агрессивное течение с признаками гистологической крупноклеточной трансформации, что ассоциируется с короткой продолжительностью жизни больных [1, 20—24]. Такая клиническая гетерогенность может отражать молекулярную гетерогенность ЛСКМЗ. Возможно, это связано с тем, что опухолевые B-клетки несут как мутированные [9, 10], так и не мутированные гены IgVH [11, 12, 25—28]. Прогностическая значимость этих молекулярных данных пока неясна, хотя в некоторых работах продемонстрированы немутированные гены IgVH при более агрессивном течении ЛСКМЗ [23, 27].

В настоящем исследовании мы проанализировали мутации генов IgVH у 24 больных ЛСКМЗ, которым диагноз установлен до СЭ на основании клинических и иммуноморфологических данных [1, 2, 29, 30]. Наши результаты показали, что у 15 (62,5%) больных ЛСКМЗ опухолевые клетки содержат мутированные гены IgVH (в большинстве случаев участвуют гены семейства VH1), а у 9 (37,5%) — немутированные.

Анализ также показал, что в 58,3% случаев при ЛСКМЗ участвуют гены семейства VH1 (в 12 случаев из 14 это ген VH1—2,), в меньшей степени — семейства VH3 и VH4. Такое избирательное участие гена VH1—2 может быть связано с патогенезом этой лимфомы.

Различные исследования при В-ХЛЛ выявили существенную неоднородность и агрессивное течение в случаях с немутированными генами [31]. Аналогичные исследования при ЛСКМЗ также показывают более агрессивное клиническое течение, гистологические признаки трансформации и плохой прогноз в случаях с немутированными генами IgVH [23—25, 27, 32].

В проведенном поисковом исследовании выявлено статистически значимое различие в группах с мутированными и немутированными генами IgVH по следующим параметрам: В-симптомы, секреция парапротеина и АИГА. В-симптомы и парапротеинемия встречались чаще у больных с мутированными, а АИГА — с немутированными генами IgVH (табл. 3). Кроме того, выявлена тенденция к более частому прогрессированию заболевания у пациентов с немутированными генами IgVH. Дальнейшее выяснение прогностической значимости мутационного статуса генов IgVH требует проведения многофакторного анализа на большем объеме выборки.

Данное исследование показало, что в большинстве случаев при ЛСКМЗ участвуют гены семействаVH1, могут быть случаи без мутаций генов IgVH, что указывает на молекулярную гетерогенность происхождения данной лимфомы. Следует также отметить, что выявлена тенденция к частому прогрессированию ЛСКМЗ в случаях с немутированными генами IgVH.