Результаты исследования очага начального кариеса эмали зуба человека in vitro с помощью атомно-силовой микроскопии

Кариес в стадии пятна — это начальная и обратимая стадия кариозного поражения эмали. Клинически видимая картина кариозного заболевания характеризуется изменением цвета эмали [1]. Такая пораженная эмаль представляет собой почти неповрежденный поверхностный слой толщиной 10—100 мкм [2]. Его ранняя диагностика имеет решающее значение, учитывая скорость перехода к необратимому повреждению эмали зуба с образованием полости [3].

По данным поляризационной микроскопии выделяют три зоны поражения: тело поражения, темную и прозрачную зоны [4]. Эти зоны связаны с наружным, подповерхностным и более глубоким слоем эмали. По данным электронной микроскопии, патологический очаг при начальном кариесе выявляет потерю неорганического вещества по периферии призм, ослабление межкристаллических связей, нарушение ориентации кристаллов, их формы, размера [2]. При этом гистологические методы выявляют одновременную деградацию мукополисхаридов межпризменных пространств [5].

Данные многочисленных исследований подтверждают проницаемость эмали зуба человека в двух направлениях [6]. Эмаль не способна к регенерации, но ее поверхность постоянно подвержена реминерализации и деминерализации. Динамическое равновесие этих процессов зависит от многих факторов, в том числе от особенностей нарушения уникальной структурной организации ткани [7, 8].

Сохранение наружного слоя эмали при деминерализации подповерхностного слоя можно объяснить способностью различных веществ активно проникать в эмаль именно с поверхности зуба за счет транспорта из слюны. Это подтверждают данные авторадиографических исследований [9]. При этом некоторые ионы включаются в кристаллическую решетку эмали. Степень проницаемости поверхности эмали является важным фактором ее сохранности на протяжении жизни человека, однако именно этот аспект недостаточно изучен [10]. От понимания строения и функции эмали зависит возможность разработки новых способов профилактики и эффективность лечения, направленного на сохранение целостности и здоровья тканей зуба.

Сканирующие зондовые микроскопы позволяют проводить минимальную предварительную подготовку поверхности, а разрешение должно быть меньше размеров отдельных кристаллитов гидроксиаппатита, что позволяет в полной мере отразить топографию и состояние поверхности эмали зуба [11, 12]. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет получить данные относительно неоднородности поверхности области кариеса в стадии «белого пятна» с высоким разрешением и дополнить уже известные факты [5, 13]. Однако многочисленные изображения поверхности эмали с помощью АСМ, представленные в отечественных [14] и зарубежных публикациях [15], ориентированы на исследования отдельных кристаллов гидроксиапатитов и их ассоциаций и носят преимущественно иллюстративный характер.

Цель исследования — выявление структурных нарушений поверхности эмали зуба человека при развитии кариозного процесса в стадии «белого пятна» in vitro с использованием АСМ.

Исследование эмали зубов человека, удаленных по ортодонтическим показаниям, проводили с помощью сканирующего зондового микроскопа Cetus Light (Nano Scan Technology, Россия), который использовали в режиме АСМ в полуконтактном режиме. Этот режим позволяет получить трехмерную картину поверхности (сканирование по высоте) и судить об отличиях в физико-химических свойствах элементов поверхности образцов. Для этого во время сканирования регистрируются различные сигналы, которые описывают изменения латеральных сил, влияющих на угол поворота кантилевера. В данной работе для описания углов поворота кантилевера мы использовали сигнал «фаза», который позволил построить изображение фазового контраста, отражающего распределение характеристик материала исследуемой поверхности эмали [16]. Результаты сканирования, полученные с помощью режима «фаза», дали нам возможность утверждать, что исследуемая поверхность состоит только из кристаллов гидроксиапатита.

Предварительно зубы извлекали из физиологического раствора и выдерживали 24 ч на воздухе при температуре +22°C. Непосредственно перед сканированием образцы продували сжатым воздухом, чтобы остаточная влажность не влияла на результаты исследования.

Объектом исследования являлась эмаль зуба человека, на поверхности которой выбирали область сканирования. Исследовали участки размером 50×50 мкм и 25×25 мкм. Исследования проведено на 10 молярах в областях с начальным кариесом в стадии «белого пятна», проведено сканирование 6 областей поверхности эмали внутри и вне зоны начального кариеса (рис. 1). Область исследования 1 — центр зоны кариеса в стадии «белого пятна»; область 2 — на расстоянии 0,2—0,4 мм от края зоны «белого пятна» внутри нее; область 3 — на расстоянии 0,5—0,8 мм от края зоны «белого пятна» вне ее; область 4 — на расстоянии 1,5—2 мм от края зоны «белого пятна» вне ее; области 5 и 6 — на расстоянии 1,5—2 мм и 2,5—3 мм от края зоны «белого пятна». В каждой зоне проведено по 5 исследований со сдвигами образца на 50 мкм в произвольном направлении. Всего проведено 300 исследований (см. рис. 1).

Рис. 1. Схематическое расположение зон АСМ-сканирования относительно области начального кариеса зуба.

Для устранения возникающих при сканировании искажений в работе использовали предварительную обработку изображений, которая заключалась в вычитании плоскости среднего наклона (приходится использовать, поскольку образец невозможно расположить точно под углом 90° к кантилеверу), вычитании поверхностей второго порядка (позволяет учесть выпуклую форму образца), коррекции нелинейных эффектов (медианная фильтрация), фильтрации шумов (с помощью Фурье-преобразования), восстановлении поверхности с учетом формы иглы.

Результаты сканирования двух поверхностей эмали зуба, полученные после предварительной обработки, приведены на рис. 2 а, б.

Рис. 2. Результаты АСМ-сканирования по высоте двух поверхностей эмали зуба в 3D-виде.

Очевидно, что поверхность, приведенная на рис. 2, а, является более гладкой по сравнению с поверхностью, приведенной на рис. 2, б. Однако если оценку неоднородности проводить по максимальному перепаду высот (цифры справа на рисунке), мы обнаружим, что на рис. 2, а перепад высот составляет 2,3 мкм, а на рис. 2, б он практически в 2 раза меньше (1,18 мкм). В качестве критерия для сравнения результатов сканирования нельзя использовать максимальный перепад высот, поскольку при этом высока вероятность того, что в область сканирования попадут единичные случайные неровности поверхности и сбои при проведении сканирования.

Для оценки неоднородности поверхности эмали в работе использовали математическую обработка результатов АСМ-сканирования, которая позволяет представить высоту всех точек сканирования в виде функции относительно распределения высот ρ(х). Эта функция, которая вычислялась с помощью программы Gwyddion, представляет собой нормированное количество точек в определенном интервале высот относительно средней плоскости скана. Таким образом, трехмерное изображение удается свести к одномерному рисунку, на котором изображено относительное количество точек в каждом интервале высот (δz). Чем более узкой будет кривая на этом рисунке, тем более ровную поверхность скана он описывает. Для удобства сравнения результатов функции относительного распределения высот для поверхности эмали зуба в области 3 и в области 1 приведены в одинаковом масштабе по оси Z. Функция относительного распределения высот, определенная для области 3, более узкая, чем для области 1. Это свидетельствует о том, что количество и размеры неоднородностей поверхности в области 3 значительно меньше, чем в области 1, и подтверждает субъективную оценку уровня «гладкости» поверхности, приведенной на рис. 2, а. Функция относительного распределения высот позволяет сравнивать неоднородности исследуемых поверхностей. Эта функция также позволяет оценить, какого рода неоднородности (углубления или «наросты») превалируют на исследуемой поверхности. Однако для случая большого числа результатов сканирования необходим более простой численный критерий. Одним из возможных критериев может выступать полуширина ∆z функции распределения точек сканирования по высоте, которая была введена и использовалась в данной работе.

Полуширина определялась таким образом, чтобы 50% точек по высоте исследуемой поверхности эмали находились в интервале ∆z. Чем меньше значение этого критерия, тем больше точек сканирования находится вблизи среднего положения, а следовательно, тем более гладкая поверхность эмали исследовалась. Результаты расчета функции распределения точек сканирования по высоте и критерия ∆z использовали для оценки величины неоднородности поверхности (рис. 3).

Рис. 3. Функции относительного распределения высот для поверхности эмали зуба в области 3 и в области 1, расположение которых приведено на рис. 1.

Обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2008, Statistica 12.0. Проводили определение среднего арифметического (М), среднеквадратичного отклонения (σ), средней ошибки среднего (m), t-критерия Стьюдента.

Результаты сканирования, полученные для области 4 для каждого из исследуемых образцов зубов, отличаются не более чем на 10% по критерию ∆z от тех, которые были получены в областях 5 и 6 (p>0,05). Результаты позволяют утверждать, что данное распределение характерно для «здоровой», неповрежденной поверхности эмали определенного зуба, и в дальнейшем приводить сравнение только для 4 из 6 поверхностей, показанных на рисунке 1. Во всех исследованных образцах области 4, 5 и 6 располагались на расстоянии более 1,5 мм от края начального кариозного процесса, на расстоянии 3 мм от жевательной поверхности зуба.

На рис. 4 приведены результаты сканирования поверхности эмали в областях, которые обозначены на рис. 1. Самая большая неоднородность поверхности наблюдалась в центре кариозной зоны (область 1). Самая маленькая — характерна для «здоровой» эмали (область 4). Для более точного сравнения результатов сканирования мы использовали функцию распределения точек по высоте.

Рис. 4. Результаты АСМ-сканирования областей поверхности эмали, показанных на рис. 1.

Функции распределения для четырех исследуемых областей поверхности эмали представлены на рис. 4, 5 в одинаковом масштабе по оси Z. Самое узкое распределение по высоте (т.е. самая «гладкая» поверхность) наблюдалась в зоне «здоровой» эмали (4); в зоне «белого пятна» (области 1, 2 и 3) больше углублений (более плавная часть левой стороны распределения), чем «наростов» (см. рис. 5). Распределение по высоте в центре «белого пятна» более широкое, чем у его края, а в зоне, расположенной около «белого пятна», отличается от распределения, характерного для «здоровой» эмали.

Рис. 5. Функции распределения, определенные для областей поверхности эмали, показанных на рис. 1.

Численные значения параметров неоднородности исследуемой поверхности можно оценить с помощью полуширины ∆z функции распределения точек сканирования по высоте. В таблице приведены значения критерия ∆z, для областей сканирования (см. рис. 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что для всех исследованных образцов «здоровая» поверхность эмали (область 4) являлась значительно более гладкой по сравнению с тем, что было получено в результате исследований в зоне «белого пятна» (области 1 и 2) и в непосредственной близости от нее (область 3). Соответствующие средние значения для критерия ∆z (M) и средняя ошибка среднего (m) для всех исследованных образцов составили: 0,130±0,012 мкм (области 4—6), 0,200±0,015 мкм (область 3), 0,417±0,050 мкм (область 2) и 0,757±0,041 мкм (область 1).

Таким образом, критерий, описывающий неоднородность поверхности, для центра зоны «белого пятна» более чем в 4 раза выше, чем для «здоровой» поверхности эмали. В области кариеса наблюдаются существенные отличия (образцы 2 и 6) в значениях критерия ∆z от среднего значения. По всей видимости, это связано с разной стадией развития кариеса и пространственным позиционированием областей измерений, поскольку среднеквадратичное отклонение для измерений, которые проводили в этих областях, не превышало 3%.

Установлено, что по среднему значению критерия ∆z неоднородность поверхности эмали в центре «белого пятна» (область 1) выше, чем на его периферии (область 2). Отличие в значениях ∆z составляет от 62% до 105%.

Также для всех исследуемых образцов неоднородность поверхности эмали в непосредственной близости к кариесу по среднему значению критерия ∆z оказалась на 30—70% выше, чем у здоровой ткани. Об этом свидетельствуют результаты АСМ-сканирования (см. рис. 4), функции распределения (см. рис. 5) и значения критерия ∆z, приведенные в таблице.

Результаты исследования критерия ∆z

Согласно t-критерию Стьюдента, разница между средними значениями ∆z, измеренными на разном расстоянии от края кариозной полости внутри и вне ее, оказалась статистически значимой. Значение t-критерия было значительно выше порогового значения, выбранного для статистической значимости p=0,001 и 50 степеней свободы (t=3,496).

Таким образом, по результатам исследования 10 образцов зубов, средняя неоднородность поверхности эмали (критерий ∆z) в непосредственной близости к кариесу в стадии «белого пятна» (области 1, 2, 3) по среднему значению оказалась статистически значимо выше (p≤0,001, при t_1—2=5,25; t_1—3=12,75; t_1—4=14,67), чем у здоровой ткани (области 4—6). Как видно из значений критерия достоверности различий (t Стьюдента), наблюдается статистически значимое постепенное уменьшение неоднородности эмали при увеличении расстояния до кариозного пятна (см. таблицу).

Последние фундаментальные и прикладные научные исследования по этой тематике сосредоточены на определении того, какие «белые пятна» и невидимые (подповерхностные) повреждения являются участками активного кариеса [17]. Клиническая процедура для выявления и оценки невидимых подповерхностных кариозных поражений в настоящее время отсутствует. Предложена система визуализации CALCIVIS, использующая технологию биолюминесценции для обнаружения свободных ионов кальция, выделяемых активными зонами поражения эмали, но нет данных о ее применении для диагностики зарождающихся поражений (менее 400 мкм). Разработан гидроксиапатит-связывающий зонд на основе бычьего гемоглобина, перспективный для обнаружения неглубоких подповерхностных кариозных поражений (на глубине 30 мкм) [18]. В совокупности новые технологии открывают перспективы для выявления и оценки кариеса зубов на самых ранних стадиях.

Использование АСМ показало, что при кариесе в стадии «белого пятна» происходят серьезные изменения в состоянии не только визуально пораженной, но и окружающей визуально неповрежденной эмали в непосредственной близости от него [13]. Проведенное исследование дополняет существующие представления о развитии начального поражения эмали зуба человека. Полученные новые данные позволяют утверждать, что ультраструктурные нарушения затрагивают непосредственно поверхностный слой, не ограничиваясь подповерхностным поражением в зоне патологического процесса. Причем в центре «белого пятна» деминерализация выражена сильнее, чем в периферических зонах, а поверхность эмали, непосредственно прилегающая к области начального кариеса, также имеет отличие от здоровой ткани (до 1 мм вокруг пятна). Отличия неоднородности поверхности эмали в видимой области начального кариеса и вокруг нее свидетельствуют о деминерализации эмали.

Установленные особенности распространения начального кариозного процесса эмали зубов можно использовать в клинической практике для диагностики и динамического наблюдения за процессами деминерализации эмали. Степень деминерализации эмали следует измерять в центре «белого пятна».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.