Применение методов метагеномного секвенирования для оценки состояния микробиоценоза при хроническом генерализованном пародонтите

Актуальность. В развитие пародонтита, несомненно, вносят вклад наследственный фактор и влияние окружающей среды, но именно влияние микрофлоры пародонта рассматривается большинством исследователей в качестве основного фактора, непосредственно определяющего начало заболевания. Вопрос о различиях в составе микробиома пациентов со здоровым пародонтом и хроническим пародонтитом остается до конца не решенным и не теряет актуальности. Изучение состава микробиома пародонта в сочетании с необходимостью учета временной динамики развития болезней пародонта позволит не только установить прогностические критерии течения и исхода пародонтита, но и разработать новые, более эффективные схемы лечения.

Цель исследования — провести сравнительное изучение состава микробиома пациентов с хроническим пародонтитом и здоровых лиц методом NGS-секвенирования.

Материал и методы. Исследование проводилось на кафедре стоматологии ИПО ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова». В нем принимали участие 10 пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) средней и тяжелой степеней тяжести в возрасте от 35 до 60 лет. В группу контроля были включены лица без признаков поражения тканей пародонта — 10 человек.

Диагноз ХГП устанавливали по степени деструкции тканей пародонтального комплекса: глубине пародонтальных карманов, подвижности зубов, данным рентгенологического исследования.

Отбор образцов осуществлялся путем введения штифта в пародонтальный карман (ПК) или в десневые бороздки вокруг зуба (в случае здорового пациента) на глубину 2—5 мм. Далее штифт помещали в реактив для хранения образцов из набора Проба-Рапид. Суммарную ДНК материала из ПК пациентов выделяли с помощью набора реагентов Проба-ГС (Россия). С применением метода NGS-секвенирования банков суммарной ДНК отделяемого ПК с праймерами на область V6 16S рДНК анализировали представленность видов и родов бактерий в микрофлоре пародонта пациентов с пародонтитом и лиц со здоровым пародонтом. Обработку данных глубокого секвенирования проводили согласно протоколу исследования.

Для секвенирования 16s-РНК ампликона гена мы выбрали в качестве мишени гипервариабельный участок V6, соотносящийся с позициями 984—1047 (Escherichiacoli), успешно отвечающий за распознавание различных филотипов. С помощью базы данных Silva был проведен анализ с применением компьютерного моделирования эксперимента, который показал, что более 97% меток V6 можно однозначно поместить на родовой уровень.

Для каждой группы пациентов было подсчитано арифметическое значение получившихся данных (% каждой операционной таксономической единицы (ОТЕ) в пробе). Затем для каждой ОТЕ рассчитывалось значение Т с учетом его релевантности для различения когорт. Значение Т более 3 означало статистически значимое преобладание ОТЕ в когорте 1 (здоровые лица). Значение Т 2—3 означало, что ОТЕ, скорее, ассоциируется со здоровым фенотипом. Значение Т менее –3 означает статистически значимую связь ОТЕ с хроническим пародонтитом. Если же значение Т варьируется между –2 и –3, то это значит, что ОТЕ преобладает у пациентов с хроническим пародонтитом. Значение Т между –2 и 2 означает, что появление ОТЕ никак не связано с воспалением пародонта.

Результаты. Сравнение количественного состава бактерий различных видов в микробиоценозе пародонта у групп пациентов с наличием и отсутствием ХГП выявило следующие закономерности: у пациентов с диагнозом ХГП наблюдается повышенное содержание в составе поддесневой микрофлоры 3 пародонтопатогенов «красного комплекса»: P. gingivalis (p=0,0001), T. forsythensis (p=0,0002) и T. denticola (p=0,0012). В среднем различия в степени обсемененности этими бактериями для групп здоровых и больных ХГП составляют: для P. gingivalis — 6,7 цикла (104 раза), для T. forsythensis — 4,3 цикла (17 раз), для T. denticola — 2,3 цикла (4,9 раза). Встречаемость A. аctinomycetemcomitansи P. intermedia,также считающихся наиболее патогенными в отношении тканей пародонта микроорганизмами, была схожей у пациентов с ХГП и в контрольной группе (p=0,09 и 0,56 соответственно). Установлено, что относительно много ОТЕ (8) четко связаны с хроническим пародонтитом. К ним относятся Porphyromonas, Treponema, Synergistaceae, Tannerella, Filifactor, Ruminococcaceae, Parvimonas и Mycoplasma. Интересно, что Treponema, Synergistaceae и Filifactor сильнее всего ассоциируются с ХГП, в то время как известные пародонтопатогены, такие как Porphyromonas и Tannerella, коррелируют с ХГП лишь частично.

Анализ показал, что род Veillonella — единственная ОТЕ, четко связанная с высокой степенью сохранности пародонта. Более того, это одна из самых многочисленных бактериальных групп (занимает третье место после Fusobacterium и Prevotella у здоровых лиц). Согласно нашим данным, у пациентов с хроническим пародонтитом количество этих бактерий в 4—5 раз меньше, чем у лиц без заболевания пародонта, что однозначно представляет собой отрицательный клинический признак.

Вывод. Предполагаемыми отрицательными маркерами следует считать высокое преобладание представителей Synergistaceae, Filifactor, Ruminococcaceae, Mycoplasma и Parvimonas, а не Aggregatibacteractinomicetecomitans, Porphyromonasgingivalis, Prevotellaintermedia, Treponemadenticola и Tannerellaforsythia. Количественное содержание микроорганизмов рода Veillonella может быть использовано в качестве маркерного признака перехода от нормального состояния пародонта к воспалению.