Анализ частоты формирования бластоцист для эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов при проведении преимплантационного генетического скрининга

Развитие преимплантационной генетической диагностики (ПГД) дает возможность исследовать эмбрионы в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) до переноса их в полость матки. Данный вид диагностики позволяет выбрать эуплоидные или генетически здоровые эмбрионы. Эта проблема наиболее актуальна для пациентов, страдающих генными или хромосомными заболеваниями (например, синдром Клайнфельтера) [1]. Установлено, что развитие эмбриона на 40% зависит от мужского фактора [2]. Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) позволяет исследовать ядра сперматозоидов для выявления в них хромосомных аномалий. Обнаружение у пациента высокого (более 1,5%) содержания анеуплоидных сперматозоидов является показанием для проведения преимплантационного генетического скрининга (ПГС) с целью выбора эуплоидного эмбриона [3]. При проведении ПГС с помощью FISH у эмбрионов, полученных методом ЭКО, на 3-й день культивирования проводят биопсию одного или двух бластомеров для последующей диагностики хромосомных аномалий в ядрах бластомеров [4]. Целью ЭКО является выбор лучшего эмбриона. Один из главных показателей нормального развития эмбрионов — формирование бластоцисты на 5-е сутки культивирования. Индекс частоты формирования бластоцист (ЧФБ) принято рассматривать как один из основных критериев для выбора эмбриона, способного к имплантации [5]. Индекс ЧФБ зависит от многих факторов и колеблется от 36 до 82% [6]. Учитывая, что ПГС методом FISH — инвазивный метод диагностики, ЧФБ для эмбрионов, подвергшихся биопсии бластомеров, ниже, чем для эмбрионов, у которых биопсию не проводили [7].

Цель настоящей работы — исследовать ЧФБ из эмбрионов после ПГС для пациентов с анеуплоидиями хромосом 18, 21, Х и Y в ядрах сперматозоидов, а также сравнить индекс ЧФБ для эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов.

Преимплантационная генетическая диагностика была проведена для эмбрионов 40 пациентов, у которых было обнаружено высокое (более 1,5%) содержание анеуплоидных сперматозоидов при исследовании хромосом 18, 21, Х и Y (норма — менее 0,25%) [8]. Средний возраст женщин в обследуемых супружеских парах составил 31,5±3,9 года, мужчин — 35,5±4,3 года. С целью ПГС была осуществлена биопсия 169 эмбрионов, проведен анализ анеуплоидий хромосом 18, 21, Х и Y в ядрах бластомеров. Флюоресцентная реакция зафиксирована для 150 эмбрионов. Перенос эуплоидных эмбрионов выполнен для 37 пациенток, у оставшихся 3 пациенток анеуплоидия по половым хромосомам или аутосомам диагностирована для всех исследуемых эмбрионов.

Для выполнения анализа ядер сперматозоидов методом FISH сперма изначально была отмыта с помощью PBS (phosphate buffer saline, «Sigma»). После этого каждый исследуемый образец был зафиксирован с помощью 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Зафиксированный препарат был выдержан при температуре –20 °С в течение 12—14 ч. Для последующей отмывки и фиксации были использованы растворы 70, 90 и 96% этанола. Для флюоресцентной гибридизации были применены следующие ДНК-зонды: CEP Y (DYZ3) Satellite  DNA SpectrumOrange, CEP X (DXZ1) Alpha Satellite  DNA SpectrumGreen, CEP 18(D18Z1) Alpha Satellite DNA SpectrumAqua, LSI 21 (loci D21S259, D21S341, D21S342, region 21q22.13-q22.2) Spectrum-Orange («Vysis-Abbott», США). С целью денатурации ДНК препарат с добавленными ДНК-зондами был в течение 10 мин выдержан при температуре 75 °С. Последующая гибридизация ДНК-зонда с ДНК-мишенью занимала 5 ч при температуре 42 °С [9]. Анализ флюоресцентного сигнала был проведен с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 80i. Полученный результат был обработан с помощью цитогенетической программы Lucia FISH (LIM, Чехия).

Для контролируемой стимуляции овуляции (КСО) пациенток применяли протокол с а-ГнРГ. В каждом случае стимуляция овуляции занимала не менее 10 дней. В день трансвагинальной пункции средний размер фолликулов достигал 18 мм. Для поддержки лютеиновой фазы были использованы препараты прогестеронового ряда. Полученные после трансвагинальной пункции ооциты и зиготы в течение 2 дней культивировали в средах Universal IVF Medium («Medicult») и Fertilization Medium («Cook»). Эмбрионы начиная с 3-го дня развития и до стадии бластоцисты культивировали в средах BlastAssist («Medicult») и Blastocyst Medium («Cook»). Ооциты и полученные после оплодотворения эмбрионы культивировали при температуре 36,8—37,0 °С при содержании СО2 5,5—5,7%. В каждом случае для переноса пациентке было выбрано 2 эуплоидных эмбриона.

Процедура биопсии была проведена на 3-й день культивирования для 169 эмбрионов, содержащих не менее 6 бластомеров, и фрагментацией не более 15%. У каждого эмбриона было биопсировано по 2 бластомера. Из 169 исследуемых эмбрионов к моменту биопсии 29,59% достигли стадии 6 бластомеров и 70,41% — стадии 7—9 бластомеров. Для биопсии была использована среда Biopsy Medium («Medicult»). Отверстие в зоне пеллюцида было выполнено с помощью лазерной установки OCTAX LaserShot (MTG, Германия). Бластомер из эмбриона извлекали с помощью механических микроманипуляторов («Narishige», Япония) и микропипеток для биопсии «Cook». Эмбрионы после биопсии культивировались в среде BlastAssist («Medicult») и Blastocyst Medium («Cook») в отдельных каплях по 25 мкл.

ПГС с помощью метода FISH был выполнен по стандартному протоколу, рекомендуемому «Abbott-Vysis» (США). Биопсированные бластомеры отдельно помещали на стекла Superfrost Plus («Kindler GmbH», Германия) в гипотонический раствор 1М HCl и 1% Tween 20 («Sigma») [10]. Ядра бластомеров были зафиксированы с помощью этанол-уксусного фиксатора при соотношении 3:1. С целью дегидратации предметные стекла с зафиксированными ядрами были проведены через 70, 90 и 96% растворы этанола. Изучение хромосомных аномалий в ядрах бластомеров по хромосомам X, Y, 18 и 21 проводилось с использованием флюоресцентных ДНК-зондов («Vysis», США). В каждом случае была использована смесь из 3 ДНК-зондов для хромосом Х, Y и 18 для бластомера 1. ДНК-зонд для хромосомы 21 был использован для бластомера 2. Флюоресцентная реакция была получена для 150 эмбрионов.

Из 150 исследуемых эмбрионов 75 (50,00%) имели нормальный набор гоносом и аутосом. У 43 (28,67%) проанализированных эмбрионов в ядрах бластомеров были обнаружены анеуплоидии по исследуемым хромосомам. У 32 (21,33%) биопсированных эмбрионов отсутствовали ядра в одном или двух выбранных для анализа бластомерах. Из 43 анеуплоидных эмбрионов 21 (48,84%) эмбрион был аномальный по количеству половых хромосом, 5 (11,63%) эмбрионов содержали аномальное число аутосом, у 17 (39,53%) эмбрионов были обнаружены анеуплоидии гоносом и аутосом одновременно (табл. 1).

Общий индекс ЧФБ для 150 эмбрионов, для которых был получен результат ПГС методом FISH, составил 54,00% (81 бластоциста). Из них 64 (79,01%) бластоцисты развились из эуплоидных эмбрионов, 15 (18,52%) бластоцист — из анеуплоидных эмбрионов, 2 (2,47%) бластоцисты — из эмбрионов, в бластомерах которых ядра отсутствовали. Фотографии отдельных найденных анеуплоидий в ядрах бластомеров представлены на рис. 1, 2.

Установлена корреляция между индексом ЧФБ и наличием у эмбриона хромосомной аномалии. Индекс ЧФБ был значительно (р<0,05) выше для эуплоидных эмбрионов по сравнению с анеуплоидными. В случае анеуплоидии индекс ЧФБ был выше (р<0,05) для эмбрионов, содержащих только аномальное число гоносом, по сравнению с эмбрионами, для которых были диагностированы анеуплоидии гоносом и аутосом одновременно. Значения индекса ЧФБ для эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов приведены в табл. 2.

После проведения ПГС перенос эмбрионов был проведен у 37 пациенток. Для 30 пациенток было перенесено по 2 эуплоидные бластоцисты, в 7 случаях была перенесена 1 эуплоидная бластоциста. Беременность наступила в 16,22% случаев (6 клинических беременностей). На настоящий момент 4 из наступивших беременностей продолжают развитие, 2 беременности закончились спонтанным абортом.

Исследование показало, что индекс ЧФБ после проведения ПГС составил 54,00%. Данное значение не отличается от среднестатистических [5, 6]. Индекс ЧФБ был в 4,6 раза выше для эуплоидных эмбрионов по сравнению с анеуплоидными (р<0,05). В случае анеуплоидных эмбрионов индекс ЧФБ был в 6,5 раза выше для бластоцист, содержащих аномальное число половых хромосом, по сравнению с эмбрионами, содержащими аномальное количество гоносом и аутосом одновременно (р<0,05). Учитывая, что ПГС методом FISH позволяет выявить анеуплоидии до проведения переноса эмбрионов в полость матки без значительного снижения индекса ЧФБ, возможно рассматривать ПГС как необходимый вид диагностики в программах ЭКО для пациентов с высоким содержанием численных хромосомных нарушений в ядрах сперматозоидов.