Ассоциация гена ССR5 с сахарным диабетом 1-го типа

Сахарный диабет 1-го типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся лимфоцитарной инфильтрацией островков Лангерганса дендритными клетками (DC), макрофагами и Т-лимфоцитами (CD4+ и CD8+) с последующим разрушением β-клеток [1], но с сохранением α-клеток, секретирующих глюкагон, и δ-клеток, секретирующих соматостатин [1, 2]. Еще одним доказательством развития именно аутоиммунного процесса являются выявляемые в сыворотке крови антитела, специфичные для собственных белков организма. Наиболее важные из таких антител — антитела к инсулину, декарбоксилазе глутаминовой кислоты (GAD65) и внутриклеточной тирозинфосфатазе (IA2) [3].

Главными генами, определяющими предрасположенность к СД1, являются гены класса II (HLA-DRB1, DQB1 и DQA1) главного комплекса гистосовместимости (MHC). Однако манифестация СД1 происходит только в том случае, если наряду с генами комплекса MHC индивид является носителем ряда других предрасполагающих генов. Одним из главных факторов является также воздействие внешней среды, природа которого пока не установлена.

К настоящему времени у русских больных СД1, проживающих в Москве, наряду с генами класса II MHC обнаружена ассоциация еще нескольких генов, предрасполагающих к СД1. Это ген CTLA4, кодирующий поверхностный рецептор Т-клеток [4], ген инсулина (INS) [5], гены PTPN22 и PTPN2, кодирующие тирозиновые фосфатазы [6], и ген SH2B3, кодирующий адаптерный белок Lnk [7].

За исключением гена инсулина, все вышеперечисленные гены кодируют факторы, связанные с формированием иммунного ответа. В связи с этим особое внимание обращает на себя рецептор хемокинов типа 5 (CCR5). Как и все рецепторы, сопряженные с G-белками, CCR5 имеет внеклеточный N-концевой участок, 7 трансмембранных доменов, соединенных внеклеточными и внутриклеточными петлями, и цитоплазматический С-концевой участок [8]. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 наблюдается в Т-лимфоцитах, в частности Т-хелперах 1-го типа (Th1), а также в дендритных клетках, моноцитах и макрофагах [9]. Вариант гена CCR5, содержащий делецию 32 п.н. в кодирующей области, приводит к синтезу укороченного и функционально неактивного варианта рецептора из-за сдвига рамки считывания [10]. При этом у гетерозиготных носителей уровень синтеза рецептора CCR5 понижен, а у гомозиготных — синтез функционально активного рецептора CCR5 полностью отсутствует [11].

CCR5 играет важную роль в регуляции иммунного ответа типа Th1, ведущего к аллогенному подавлению β-клеток островков Лангерганса при СД1 [12]. Пониженная экспрессия хемокиновых рецепторов CCR5, ассоциированных с Th1, обнаружена в моноцитах периферической крови больных с недавно выявленным СД1 [13]. Хорошо изучена роль хемокинов в качестве аттрактантов для нативных и эффекторных Т-клеток [8, 14]. В ряде исследований [15] показано, что хемокины имеют важное значение и в регуляции Т-клеточной дифференцировки, а также влияют на поляризацию иммунного ответа по типу Th1 или Th2.

Недавно обнаружено, что аллель del32 гена ССR5 с высокой частотой обнаруживается у носителей аллелей HLA-DRB1*01 и DRB1*04 [16]. Ассоциация варианта del32 гена ССR5 была выявлена с такими аутоиммунными заболеваниями, как рассеянный склероз, целиакия и СД1 [17, 18]. Следует отметить, что носители генотипа del32/del32 гена ССR5 имеют пониженный риск развития СД1 [18]. Механизм развития данных заболеваний сходен и в значительной степени связан с аутоиммунной неспецифичной реакцией Т-лимфоцитов на периферические ткани организма и интолерантностью к антигенам, поступающим с пищей [18].

Однако в двух исследованиях, проведенных на шведской [19] и британской [20] популяциях, ассоциации с СД1 обнаружено не было. Таким образом, возникает вопрос, насколько существенен вклад гена ССR5 (вариант del32) в формирование генетической предрасположенности к СД1 среди русских больных СД1, проживающих в Москве. Именно эта задача и была поставлена в данной работе.

В работе использовали образцы крови от больных СД1 (177 человек) и здоровых индивидов (408) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ.

Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [21].

Идентификацию генотипов гена CCR5, кодирующего рецептор хемокинов типа 5, проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (TaqMan) на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems») в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 100 нМ зондов, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. В составе реакционной смеси для амплификации присутствуют флуоресцентномеченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени и разрушаются Taq-полимеразой, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции в зависимости от наличия мутации. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала.

Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 58 °C/60 — всего 40 циклов. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (χ²). Значимыми считали различия при p<0,05. Относительный риск развития заболевания рассчитывали по отношению шансов (OR). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR >1 как положительную ассоциацию (повышенный риск развития патологии), OR <1 — как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случай—контроль» [22].

Как в группе больных СД1 («СД+»), так и в группе здоровых индивидов («СД–») преобладал аллель без делеции 32 п.н. (аллель A, более 80%), то же самое характерно и для генотипов (генотип A, более 70%) (см. таблицу).

Наши данные противоречат результатам, полученным на британской популяции и подтвержденным на семьях из нескольких европейских стран [18]. В этом исследовании было показано, что носители аллеля del32 гена ССR5 имеют пониженный риск развития СД1. Следует отметить, что вклад гена ССR5 в формирование предрасположенности к СД1 минимален как в русской, так и в британской популяциях.

Кроме того, в двух исследованиях, проведенных на шведской популяции [19] и на другой выборке из британской популяции [20], ассоциации с СД1 вообще обнаружено не было. Эти противоречия, возможно, связаны с эпистатическим взаимодействием генов комплекса HLA класса II между собой и с генами, включенными в аутоиммунную реакцию, одним их которых является CCR5 [23].

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что носители генотипа del32/del32 гена ССR5 среди русских больных, проживающих в Москве, имеют повышенный риск развития аутоиммунного СД1.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Г. Никитин, В.В. Носиков, И.И. Дедов, О.И. Копылова

Сбор и обработка материала — Т.Л. Кураева, Г.Е. Смирнова, В.А. Петеркова, Е.Ю. Лаврикова, О.И. Копылова

Статистическая обработка данных — А.Г. Никитин, О.И. Копылова

Написание текста — А.Г. Никитин, О.И. Копылова, В.В. Носиков

Редактирование — В.В. Носиков

Конфликт интересов и финансовая заинтересованность авторов отсутствуют.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт 16.512.11.2045) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-01443-а).